ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 Tubo soldado frente e verso para o componente químico da indústria química. A deficiência de SPECC1L leva ao aumento da estabilidade das juntas emendadas e à redução da eliminação de células da crista neural craniana.

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ASTM A790 2507/2205 tubos 1,4462/1,4410 soldados frente e verso para a indústria química

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As células da crista neural craniana (CNCC) se desprendem das pregas neurais embrionárias e migram para os arcos faríngeos, que formam a maioria das estruturas da face média.A disfunção do CNCC desempenha um papel importante na etiologia da fissura orofacial, uma malformação congênita comum.Mutações heterozigóticas de SPECC1L foram encontradas em pacientes com fissuras atípicas e sindrômicas.Aqui, relatamos coloração aprimorada de componentes de junção adesiva canônica (AJ), β-catenina e E-caderina em células knockdown SPECC1L cultivadas, e micrografias eletrônicas mostram difusão apical-basal de AJ.Para entender o papel do SPECC1L na morfogênese craniofacial, criamos um modelo de camundongo deficiente em Specc1l.Mutantes homozigotos são letais embrionários e apresentam fechamento do tubo neural prejudicado e laminação do CNCC.A coloração da proteína AJ está aumentada nas dobras neurais mutantes.Este defeito AJ é consistente com um defeito na delaminação do CNCC, exigindo a dissolução do AJ.Além disso, os mutantes Specc11 reduziram a sinalização PI3K-AKT e aumentaram a apoptose.In vitro, a inibição moderada da sinalização PI3K-AKT em células do tipo selvagem foi suficiente para induzir alterações de AJ.É importante ressaltar que as alterações de AJ induzidas pelo knockdown de SPECC1L podem ser revertidas pela ativação da via PI3K-AKT.Tomados em conjunto, estes dados sugerem que o SPECC1L, como um novo regulador da sinalização PI3K-AKT e da biologia AJ, é necessário para o fechamento do tubo neural e a estratificação do CNCC.
As células da crista neural craniana (CNCCs) localizam-se no neuroectoderma dorsal e se separam do neuroepitélio das dobras neurais em desenvolvimento através de um processo que envolve a transição epitelial-mesenquimal (EMT) .Os CNCCs epiteliais pré-migrados rompem as junções intercelulares e tornam-se CNCCs mesenquimais migratórios que preenchem o primeiro e o segundo arcos faríngeos e formam a maior parte da cartilagem craniofacial.Assim, os genes que regulam a função do CNCC são frequentemente interrompidos na etiologia das anomalias congênitas craniofaciais, como as fissuras orofaciais, afetando mais comumente 1/800 nascimentos somente nos EUA.Uma das deformidades congênitas8.
A delaminação do CNCC coincide com o fechamento do tubo neural anterior entre 8,5 e 9,5 dias de desenvolvimento embrionário em camundongos.Mutantes de vários genes associados à fissura orofacial de camundongos também exibem alguma forma de defeito do tubo neural, incluindo Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 e Pdgfrα12.No entanto, os processos de fechamento do tubo neural e estratificação do CNCC podem ser considerados independentes, pois o camundongo mutante Splotch (Pax3) apresenta defeitos no fechamento do tubo neural sem qualquer efeito na estratificação ou migração do CNCC .Modelos adicionais de camundongos com defeitos na dissecção do CNCC e no fechamento do tubo neural ajudarão a delinear a base molecular comum desses dois processos.
O isolamento do CNCC das células neuroepiteliais requer a dissolução de junções adesivas (AJs), que são compostas por complexos proteicos contendo, entre outros, E-caderina, β-catenina, α-E-catenina e α-actinina associadas a filamentos de actina 2 Estudos de superexpressão da E-caderina em pregas neurais mostraram uma redução ou atraso na delaminação do CNCC.Por outro lado, a supressão da E-caderina resulta em estratificação precoce15,16.Muitos dos fatores que medeiam a EMT durante a estratificação do CNCC são fatores de transcrição (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) e proteínas de remodelação da matriz extracelular (ECM), como metaloproteinases de matriz (MMPs), no entanto, os CNCCs são reguladores diretos de AJ do citoesqueleto. ainda não conhecido.A via PI3K-AKT é conhecida por antagonizar os níveis de E-caderina, principalmente em pesquisas sobre o câncer.Estudos recentes mostraram que a perda da sinalização PI3K-AKT baseada em PDGFα em camundongos leva a anormalidades craniofaciais, incluindo fenda palatina e defeitos do tubo neural .No entanto, a relação entre a via PI3K-AKT e a estabilidade do AJ na estratificação do CNCC não é clara.
Anteriormente, identificamos o SPECC1L como o primeiro gene mutante em duas pessoas com uma fissura grave que se estende da boca ao olho, conhecida como fissura oblíqua (ObFC) ou fissura Tessier IV18.Mutações SPECC1L foram identificadas em duas famílias multigeracionais com a síndrome autossômica dominante de Opitz G/BBB (OMIM #145410), nas quais os indivíduos afetados exibiam hiperdistância e fissura labiopalatina19, e em uma família com síndrome de sobredistância de Tibi (OMIM #145420)20 .mais da metade dos casos de síndrome Opitz G/BBB estão ligados ao cromossomo X (OMIM #300000) e são causados ​​por mutações no gene MID1, que codifica a proteína 22 do esqueleto celular associado aos microtúbulos.Nossa hipótese é que a SPECC1L, também uma proteína associada aos microtúbulos e ao citoesqueleto de actina, pode mediar a sinalização necessária para a remodelação do citoesqueleto de actina durante a adesão e migração celular 18 .Através de estudos in vitro e in vivo, descrevemos agora o SPECC1L como um novo regulador da estabilidade de AJ através da sinalização PI3K-AKT.No nível celular, a deficiência de SPECC1L resultou em diminuição do nível da proteína pan-AKT e aumento na dispersão apical-basal de AJ, que foi eliminada pela ativação química da via AKT.In vivo, embriões deficientes em Specc11 apresentam comprometimento do fechamento do tubo neural e redução da dissecção do CNCC.Assim, o SPECC1L funciona na sinalização baseada na adesão celular altamente regulada, necessária para a função normal do CNCC durante a morfogênese facial.
Para caracterizar o papel do SPECC1L no nível celular, utilizamos a linha celular de osteossarcoma estável U2OS descrita anteriormente, deficiente em SPECC1L18.Essas células U2OS estáveis ​​com knockdown de SPECC1L (kd) tiveram uma diminuição moderada (60-70%) nos níveis de transcritos e proteínas de SPECC1L, juntamente com defeitos na migração e reorganização do citoesqueleto de actina 18. Em contraste, uma diminuição transitória grave em Foi demonstrado que SPECC1L leva a defeitos mitóticos 23 .Após caracterização adicional, descobrimos que nossas células SPECC1L-kd estáveis ​​alteraram a morfologia em um grau muito alto de confluência (Figura 1).Células de controle individuais e células kd em baixa confluência pareciam semelhantes(Figura 1A,D).24 horas após a fusão, as células de controlo mantiveram a sua forma cuboidal (Fig. 1B, E), enquanto as células SPECC1L-kd alongaram (Fig. 1C, F).A extensão desta mudança na forma celular foi capturada por imagens ao vivo in vivo de células de controle e células kd (filme 1).Para determinar o papel do SPECC1L em células confluentes, primeiro examinamos sua expressão.Descobrimos que os níveis de proteína SPECC1L aumentaram após a fusão (Figura 1G), enquanto os níveis de transcrição SPECC1L não aumentaram (Figura 1H).Além disso, à medida que a densidade celular aumentou, a proteína SPECC1L acumulou-se nas fronteiras intercelulares (Fig. 2A-E), com um padrão que se sobrepõe ao da β-catenina associada à membrana (Fig. 2A'-E').Dada a associação do SPECC1L com o citoesqueleto de actina 18,23 levantamos a hipótese de que o SPECC1L interage com junções adesivas baseadas em actina (AJ).
(AF) Células knockdown SPECC1L (DF) alongam-se em alta confluência (F) em comparação com células U2OS de controle (AC).Aqui são mostrados três dos seis pontos de tempo (T1, T3, T6) que selecionamos para diferentes densidades celulares.(G) Análise de Western blot mostrando que a proteína SPECC1L está estabilizada em um alto grau de confluência em comparação com um baixo grau de confluência nas células de controle.Western blot de SPECC1L mostra a banda esperada de 120 kDa e uma banda de peso molecular mais elevado, possivelmente modificada pós-tradução (*).A análise Western blot foi realizada nas mesmas condições para baixa e alta confluência.Imagens mostrando SPECC1L em baixa e alta confluência foram tiradas do mesmo blot.A mesma mancha foi removida e reexaminada com anticorpo β-actina.(H) A análise quantitativa de RT-PCR não mostrou alterações significativas nos níveis de transcrição SPECC1L.As barras de erro representam SEMs de quatro experimentos independentes.
(AE) Escolhemos seis pontos no tempo (T1-T6) representando uma faixa de densidades celulares para normalizar a análise do formato celular e alterações de AJ em células U2OS com knockdown de SPECC1L (kd).Os primeiros cinco destes pontos de tempo incluíram células únicas (T1), fusão de 50-70% de pequenos aglomerados de células (T2), fusão sem remodelação de células kd (T3), remodelação de células kd (T4) e alterações de 24 horas.na forma posterior de células kd (T5).A proteína SPECC1L foi predominantemente dispersa no citoplasma em T1 (A), mas seu acúmulo foi observado nas fronteiras intercelulares em momentos subsequentes (B – E, setas).(FJ) A β-catenina mostra acumulação semelhante nas fronteiras intercelulares associadas ao complexo AJ.(A'-E') SPECC1L e β-catenina mostram coloração sobreposta nas bordas celulares em alta densidade celular (setas).(F'-J') Nas células SPECC1L-kd, a coloração de β-catenina parece normal em baixa densidade celular (F'-H'), mas se expande à medida que o formato da célula muda (I', J'; setas), indicando que AJ mudou.Barras = 10 µm.
Tentamos então determinar o efeito da deficiência de SPECC1L em AJ.Utilizamos vários marcadores associados ao AJ, incluindo os componentes canônicos F-actina, miosina IIb, β-catenina e E-caderina24,25,26,27.As fibras de estresse de actina aumentaram nas células SPECC1L-kd conforme descrito anteriormente (Fig. 3A, B) 18 .A miosina IIb associada aos filamentos de actina mostrou um aumento semelhante nas células SPECC1L-kd in vitro (Fig. 3C, D).A β-catenina associada a AJ liga-se à caderina na membrana celular, mostrando um padrão de expressão normal em “favo de mel” em cubócitos de controle (Fig. 3E, G).Curiosamente, em imagens planas usando microscopia confocal, a coloração de β-catenina (Fig. 3E, F) e E-caderina (Fig. 3G, H) na membrana celular de células deficientes em SPECC1L confluentes mostrou padrões proeminentes de coloração estendida.Esta expansão da coloração de β-catenina associada a AJ em células kd foi mais pronunciada na confluência, mas pareceu preceder alterações na forma celular (Fig. 2F-J, F'-J').Para determinar a natureza física desta coloração AJ estendida, examinamos as bordas celulares na superfície apical-basal das células SPECC1L-kd U2OS por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) (Figura 3I, J).Em contraste com as células de controle (Fig. 3I), que tinham regiões eletrodensas separadas indicativas de AJ (setas), as células kd (Fig. 3J) mostraram regiões grandes e contíguas de alta densidade eletrônica indicativas de AJ ao longo do plano apicobasal..Além disso, em cortes transversais, observamos extensas dobras de membrana celular em células kd (Fig. S1A, B), o que explica o padrão estendido de bandas de coloração de β-catenina e E-caderina (Fig. 3F, H).Em apoio ao papel de SPECC1L em AJs, a β-catenina foi co-imunoprecipitada com SPECC1L em lisados ​​de células U2OS confluentes (Fig. 3K).Juntamente com a imunocoloração estendida para marcadores AJ, a análise TEM foi consistente com nossa hipótese de que a deficiência de SPECC1L aumenta a densidade e a variância apical-basal de AJ.
(AH) Aumento da coloração de F-actina em células kd 48 horas pós-fusão (T6; A, B).Coloração alterada de miosina IIb associada à F-actina (C, D).O padrão suave de coloração da membrana de β-catenina e E-caderina nas células controle (E, G) foi aumentado nas células SPECC1L-kd (F, H).Barras = 10 µm.(I – J) Micrografias eletrônicas observando a junção intercelular apical-basal.As células de controle mostram regiões distintas de elétrons densos, indicando junções pegajosas (I, setas).Em contraste, toda a junção apical-basal nas células SPECC1L-kd parecia eletrodensa (J, setas), indicando aumento da densidade e dispersão das junções adesivas.(K) A β-catenina foi co-imunoprecipitada com SPECC1L em lisados ​​​​de células U2OS confluentes.Imagem tirada de um ponto representando um dos quatro experimentos independentes.
Para entender o papel do SPECC1L na morfogênese craniofacial, criamos um modelo de camundongo deficiente em Specc1l usando duas linhagens de células ES independentes, DTM096 e RRH048 (BayGenomics, CA), que representam o íntron 1 e os transcritos de Specc1l foram capturados em 15 (Fig. 1) .4A, figura S2).A localização genômica da inserção do vetor chamariz foi determinada pelo sequenciamento do genoma completo e confirmada por PCR (Fig. S2).Ambos os projetos de armadilhas genéticas também permitiram a fusão in-frame dos repórteres Specc11-lacZ após a captura.Portanto, a expressão de lacZ determinada pela coloração X-gal foi utilizada como indicador da expressão de Specc11.Ambos os alelos mostraram padrões de expressão lacZ semelhantes, com a armadilha do gene DTM096 no íntron 1 mostrando expressão mais forte do que RRH048 no íntron 15 (não mostrado).No entanto, Specc1l é amplamente expresso, com expressão particularmente forte nas dobras neurais em E8.5 (Figura 4B), no tubo neural e nos processos faciais em E9.5 e E10.5 (Figura 4C,D), e no desenvolvimento de membros na E10.5 e olhos (Figura 4D).Relatamos anteriormente que a expressão de SPECC1L no primeiro arco faríngeo em E10.5 estava presente no epitélio e no mesênquima subjacente, consistente com a linhagem CNCC.Para testar a expressão de SPECC1L em CNCC, realizamos dobras neurais E8.5 (Figura 4E-J) e seções de crânio E9.5 (Figura 4K-).Em E8.5, o SPECC1L corou intensamente as dobras neurais (Fig. 4E, H), incluindo células coradas com marcadores NCC (Fig. 4G, J).Em E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) corou fortemente o CNCC migratório co-corado com AP2A (Fig. 4L, M) ou SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Representação esquemática do gene Specc11 de camundongo mostrando inserção de vetor chamariz em clones de células ES DTM096 (íntron 1) e RRH048 (íntron 15).(BD) coloração lacZ de embriões Specc1lDTM096 heterozigotos representando expressão Specc1l de E8.5 a E10.5.NE = neuroectoderma, NF = prega neural, PA1 = primeiro arco faríngeo.(EP) Imunocoloração SPECC1L com marcadores NCC AP2A e SOX10 em dobras neurais E8.5 (NF; EJ) e seções de crânio E9.5 (KP).A coloração SPECC1L foi amplamente observada nas dobras neurais E8.5 (E, H; pontas de seta), incluindo células marcadas com AP2A (F, G; pontas de seta) e SOX10 (I, J; pontas de seta).Em E9.5, SPECC1L corou fortemente CNCCs migrantes (K, N; setas) rotulados como AP2A (L, M; setas) e SOX10 (O, P; setas).
O cruzamento entre camundongos heterozigotos Specc1lDTM096 / + e Specc1lRRH048 / + mostra que os dois alelos de armadilha genética não são complementares e que heterozigotos compostos e homozigotos embrionários para qualquer alelo de armadilha genética são letais embrionários (Tabela S1).As razões mendelianas indicaram uma diminuição na taxa de sobrevivência de heterozigotos ao nascer (esperado 1,34 vs. 2,0).Observamos baixa mortalidade perinatal entre heterozigotos, alguns apresentavam anomalias craniofaciais (fig. S3).No entanto, a baixa penetrância destes fenótipos craniofaciais perinatais torna difícil o estudo dos seus mecanismos fisiopatológicos subjacentes.Portanto, focamos no fenótipo letal embrionário de mutantes Specc11 homozigotos.
A maioria dos embriões mutantes Specc1lDTM096 / RRH048 heterozigotos ou homozigotos compostos não se desenvolveram após E9.5-10.5 (Figs. 5A-D), e o tubo neural não fechou anteriormente (Figs. 5B, D) e às vezes fechou posteriormente (não mostrado) ..Este defeito de fechamento do tubo neural craniano foi associado à maioria dos CNCC marcados como DLX2 permanecendo nas dobras neurais em E10.5, indicando nenhuma dissecção (Figura 5A'-D').Para determinar se o tamanho geral do CNCC também foi reduzido, marcamos as linhas CNCC com GFP em nossas linhas de armadilha genética com Wnt1-Cre e ROSAmTmG.Transmitimos GFP+ NCC e GFP- (RFP+) não-NCC classificados de embriões inteiros.Em E9.5, a proporção de CNCCs marcados com GFP classificados por fluxo não mudou significativamente entre embriões WT e mutantes (não mostrados), indicando especificação normal de CNCC.Portanto, levantamos a hipótese de que a coloração residual de Wnt1-Cre e DLX2 em dobras neurais expostas (Figura 5B') era devida a camadas CNCC defeituosas, possivelmente devido ao aumento da densidade ou dispersão de células AJ, como visto em células SPECC1L-kd.Utilizamos os marcadores NCC SOX10, AP2A e DLX2 para confirmar a presença de CNCC na prega neural (Figura 5E-R).Em E8.5, a coloração de dobras neurais para todos os três marcadores NCC foi observada em seções de WT (Fig. 5E, G, I) e mutante Specc1l (Fig. 5F, H, J).Em E9.5, enquanto os marcadores NCC coraram o NCC migratório nas seções WT (Fig. 5M, O, Q), a coloração residual do NCC foi observada em dobras neurais expostas de embriões mutantes Specc1l (Fig. 5N, P, R).Como SOX10 e DLX2 marcam CNCCs em migração, este resultado sugere que CNCCs deficientes em SPECC1L alcançam especificação pós-migratória, mas não conseguem migrar de dobras neurais.
A deficiência de Specc11 leva ao fechamento defeituoso do tubo neural, delaminação das células da crista neural craniana e AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrião transportando células migratórias da crista neural craniana (CNCC) marcadas com Wnt1-Cre (A').Em contraste, os embriões mutantes Specc11 apresentam dobras neurais abertas (B), pontas de seta) e CNCCs que não migraram (B', pontas de seta).(C, D') Imagens de campo claro (C, D') e imunocoloração (C', D') do marcador CNCC DLX2 de embriões E10.5 WT (C, C') e Specc1l (D, D').Nos embriões WT E10.5, o CNCC positivo para DLX2 coloniza os arcos branquiais (C', setas), enquanto nos mutantes, a coloração conspícua persiste nas dobras neurais abertas (D', setas) e nos primeiros arcos faríngeos (D', Setas; flechas).) com alguma coloração (setas) indicando má delaminação e migração de CNCC.ER) Seções de embriões mutantes WT e Specc1l nos estágios E8.5 (E – L) e E9.5 (M – R) foram marcadas com marcadores NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) e DLX2 (I, J, Q, R).Em E8.5, a coloração NCC foi observada em dobras neurais de tipo selvagem (NF) e seções mutantes.A co-coloração de SOX10 e β-catenina em E8.5 WT (K) e mutante (L) revelou aumento da coloração de β-catenina nos limites celulares nas dobras neurais.Em E9.5, foi observada coloração de tipo selvagem de CNCCs em migração (M, O, Q), enquanto em mutantes, CNCCs não estratificados coraram dobras neurais abertas (N, P, R).(S – Z) Análise de marcação AJ in vivo em seções coronais de embriões WT e Specc11DTM096/RRH048 com a mutação E9.5.Um plano seccional aproximado é mostrado no canto superior direito.Em secções de tecidos mutantes, foi observado aumento da coloração de F-actina (S, T) e miosina IIb (U, V).Semelhante aos resultados in vitro na Fig. 3, em embriões mutantes, foi observada coloração melhorada da membrana para β-catenina (W, X) e E-caderina (Y, Z).(AA-BB) Uma micrografia eletrônica de uma seção de um embrião de tipo selvagem olhando além da borda da célula basal apical mostra uma região distinta de elétrons densos, indicativa de junções adesivas (AA, setas).Em contraste, em seções de embriões mutantes Specc11 (BB, setas), toda a junção apicobasal é eletrodensa, indicando um aumento na densidade e dispersão das junções adesivas.
Para testar nossa hipótese de que a redução da estratificação é devida à alteração de AJ, examinamos a marcação de AJ em dobras neurais expostas de embriões mutantes Specc1l (Fig. 5S-Z).Observamos um aumento nas fibras de estresse de actina (Fig. 5S, T) e um aumento concomitante da localização da coloração de miosina IIB nas fibras de actina (Fig. 5U, V).É importante ressaltar que observamos aumento da coloração de β-catenina (Fig. 5W, X) e E-caderina (Fig. 5Y, Z) nos limites intercelulares.Também examinamos a coloração de β-catenina de NCC nas dobras neurais de embriões E8.5 (Fig. 5K, L).A coloração de β-catenina pareceu ser mais forte nas dobras neurais mutantes Specc1l (Fig. 5L e K), sugerindo que as alterações de AJ haviam começado.Em micrografias eletrônicas de seções de crânio de embriões E9.5, observamos novamente aumento da coloração eletrodensa difusa em embriões mutantes Specc1l em comparação com WT (Fig. 5AA, BB e S1E-H).Tomados em conjunto, estes resultados apoiam os nossos resultados in vitro em células SPECC1L-kd U2OS e sugerem que a coloração aberrante de AJ precede a estratificação do CNCC nos nossos embriões mutantes.
Dada a conhecida relação antagônica entre a atividade da AKT e a estabilidade da E-caderina,17,28 levantamos a hipótese do envolvimento da sinalização PI3K-AKT.Além disso, observamos bolhas subepidérmicas em alguns de nossos embriões mutantes que escaparam da letalidade (<5%) em E9.5-10.5 e, em vez disso, estabeleceram-se em torno de E13.5 (Fig. S3).As vesículas subepidérmicas são uma marca registrada da sinalização reduzida de PI3K-AKT com base em PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) relataram que a interrupção da ativação de PI3K baseada em PDGFRα em embriões mutantes PdgfraPI3K / PI3K resulta em vesículas subepidérmicas, defeitos do tubo neural e fenótipos de fenda palatina.De facto, os níveis de pan-AKT e Ser473-AKT fosforilado activo foram reduzidos in vivo em tecidos mutantes Specc1l para paragem embrionária E9.5 (Fig. 6A-D).A diminuição nos níveis de Ser473-AKT fosforilado pode ser inteiramente devida à diminuição nos níveis de pan-AKT in vivo (FIG. 6E) e in vitro (FIG. 6F).Uma diminuição in vitro foi observada apenas quando as células U2OS eram fortemente confluentes com alterações na forma celular e na densidade de AJ (Figura 6D).Assim, nossos dados sugerem que o SPECC1L é um novo regulador positivo da sinalização PI3K-AKT na morfogênese craniofacial.
(A – E) Seções de crânio E8.5 (A,B) e E9.5 (C,D) ou lisados ​​E9.5 de embriões mutantes Specc1l (E) mostrando níveis de redução de proteína S473-AKT fosforilada ativa e pan-AKT , em comparação com o controle WT.Western blotting foi realizado em lisados ​​de tipo selvagem e lisados ​​mutantes sob as mesmas condições.As imagens mostradas para SPECC1L foram tiradas de um borrão.A mesma mancha foi removida e reexaminada com anticorpos anti-pan-ACT e β-actina.Os níveis de Pan-AKT nas dobras neurais E8.5 (A, B) e os níveis de S473-AKT fosforilado nas seções do crânio E9.5 foram significativamente reduzidos.(F) Os níveis de Pan-AKT foram reduzidos de forma semelhante em lisados ​​​​de células U2OS SPECC1L-kd colhidas em alta confluência.As barras de erro representam SEMs de três quantificações independentes de Western blot.(GJ) Seções de embriões WT em E9.5 corados com KI67 e caspase 3 clivada, respectivamente, mostrando proliferação celular (G, G') e pouca atividade apoptótica (H, H').Os embriões mutantes Specc11 apresentam proliferação celular comparável (I), mas o número de células submetidas a apoptose é significativamente aumentado (J).
Em seguida, examinamos marcadores de proliferação e apoptose.Não observamos qualquer diferença na proliferação de embriões E9.5 (Fig. 6E, G comparado a I) com um índice de proliferação de 82,5% para mutantes WT e 86,5% para mutantes Specc1l medido por coloração KI67 (p <0,56, Fisher's teste exato).Da mesma forma, não observamos qualquer diferença na apoptose medida pela coloração para caspase 3 clivada em dobras neurais em E8.5 até a parada do embrião (não mostrado) (não mostrado).Em contraste, a apoptose foi significativamente aumentada em todos os embriões mutantes E9.5 (Fig. 6F, H e J).Este aumento global na apoptose é consistente com a redução da sinalização PI3K-AKT e a letalidade embrionária precoce29,30,31.
Em seguida, para confirmar um papel causal para a sinalização PI3K-AKT nas alterações de AJ em nossas células kd, alteramos quimicamente a via nas células controle e kd (Figura 7A-F).Usamos como marcador o fenótipo de mudança de formato celular observado em células confluentes SPECC1L-kd, que quantificamos usando a razão entre a dimensão mais longa (comprimento) e a dimensão vertical correspondente (largura).Uma proporção de 1 é esperada para células relativamente redondas ou cubóides (Figura 7G).Além da forma celular, também confirmamos o efeito em AJ pela coloração com β-catenina (Fig. 7A'-F').A inibição da via PI3K-AKT usando wortmanina foi suficiente para alterar a forma celular nas células controle (Figura 7A,C) e AJ (Figura 7A').O ativador PI3K-AKT SC-79 não afetou o formato celular (FIG. 7A, E) ou a expansão AJ (FIG. 7A') em células de controle.Nas células SPECC1L-kd, a supressão adicional da via PI3K-AKT resultou no aumento da apoptose (Fig. 7B, D) e num aumento acentuado na coloração de β-catenina (Fig. 7B'), consistente com os nossos mutantes pesados ​​in vivo.É importante ressaltar que a ativação da via PI3K-AKT melhorou significativamente a forma celular (Figura 7B,F) e os fenótipos AJ (Figura 7B”).As alterações na forma celular foram quantificadas como razão de redondeza celular (CCR) e comparadas quanto à significância conforme descrito acima (FIG. 7G).De fato, nas células controle (Fig. 7G, CCR = 1,56), o tratamento com wortmanina foi suficiente para alterar significativamente a forma celular (Fig. 7G, CCR = 3,61, p <2,4 × 10-9) na medida semelhante à observada. em SPECC1L.células -kd (Fig. 7G, CCR = 3,46).O tratamento com wortmanina de células SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 3,60, insignificante) não foi mais significativo do que células kd não tratadas (Fig. 7G, CCR = 3,46, insignificante) ou células de controle tratadas com wortmannina (Fig. 7G)., CCR = 3,46, insignificante) afeta adicionalmente o alongamento celular (7G, CCR = 3,61, insignificante).Mais importante ainda, o ativador SC-79 AKT restaurou o fenótipo alongado das células SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Estes resultados confirmam que o SPECC1L regula a sinalização PI3K-AKT e sugerem que uma diminuição moderada no SPECC1L afeta a adesão celular, enquanto uma forte diminuição leva à apoptose (Fig. 8).
(A – F') Células controle (A, C, E) e SPECC1L-kd (B, D, F) tratadas com inibidor da via PI3K-AKT wortmanina (C, D) ou ativador SC-79 (E, F) Tratamento As células de controle não tratadas são cubóides (A) com coloração celular de β-cat normal (A'), enquanto as células kd são alongadas (B) com coloração aumentada de β-cat (B').Após a supressão da via PI3K-AKT, as células de controle alongaram-se (C) com expansão de β-cat (C'), enquanto as células kd começaram a sofrer apoptose (D), semelhante aos nossos embriões altamente mutados e mostrando β-cat extremamente aprimorado.coloração (D').Após a ativação da via PI3K-AKT, as células de controle permaneceram cubóides (E) e apresentaram coloração normal de β-cat (E'), enquanto as células kd apresentaram coloração significativamente melhorada no formato celular (F) e β-cat (F'), indicando (G) O grau de alteração da forma celular em (AF) foi quantificado usando a razão de redondeza celular (CCR) da dimensão mais longa (comprimento) e a dimensão vertical correspondente (largura) usando o software MetaMorph.Células SPECC1L-kd não tratadas (NT) (CCR = 3,46) foram significativamente mais longas que as células controle (CCR = 1,56, p <6,1 × 10–13).A inibição da via PI3K-AKT pelo mosto nas células controle foi suficiente para causar um alongamento semelhante no formato celular (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Da mesma forma, a ativação de AKT por SC-79 em células SPECC1L-kd restaurou o alongamento celular para níveis de controle (CCR = 1,74, p <6,2 × 10–12).O tratamento com wortmanina de células SPECC1L-kd resultou em aumento da apoptose, mas nenhum aumento adicional na alteração da forma celular (CCR = 3,60) em comparação com células kd não tratadas (CCR = 3,46, ns) ou células de controle tratadas com wortmanina (3,61) observadas em .ns = não importa.+/- Medições SEM para 50 células são mostradas.As diferenças estatísticas foram calculadas utilizando o teste t de Student.
(A) Representação esquemática da inibição e ativação da via PI3K-AKT resultando em alterações de AJ e resgate, respectivamente.(B) Modelo proposto para estabilização da proteína AKT por SPECC1L.
CNCCs pré-migratórias requerem lise AJ para se separarem das células neuroepiteliais da prega neural anterior .O aumento da coloração dos componentes AJ e a perda da distribuição assimétrica apical-basal de AJ em células deficientes em SPECC1L tanto in vitro como in vivo, combinados com a proximidade física de SPECC1L à β-catenina, sugerem que SPECC1L funciona para manter adequadamente a estabilidade local de AJ para músculos da organização.citoesqueleto de actina.A associação de SPECC1L com o citoesqueleto de actina e β-catenina e o aumento no número de filamentos de actina condensados ​​na ausência de SPECC1L é consistente com o aumento observado na densidade de AJ.Outra possibilidade é que um número aumentado de fibras de actina em células deficientes em SPECC1L leve a uma alteração na tensão intercelular.Como o estresse celular afeta a dinâmica do AJ 33, as alterações de voltagem podem resultar em AJ 34 mais difuso.Portanto, quaisquer alterações afetarão as camadas do CNCC.
Wnt1 é expresso nas primeiras dobras neurais que dão origem às células da crista neural.Assim, o rastreamento da linhagem Wnt1-cre marca o NCC35 pré e migratório.No entanto, Wnt1 também marca clones de tecido cerebral dorsal também derivados de dobras neurais iniciais 35,36, tornando provável que a nossa coloração de mutantes E9.5 para marcadores Wnt1 em dobras neurais abertas não seja CNCC.Nossa coloração positiva para os marcadores NCC AP2A e SOX10 confirmou que as dobras neurais expostas dos embriões mutantes Specc11 continham de fato CNCC.Além disso, uma vez que AP2A e SOX10 são marcadores de NCC de migração precoce, a coloração positiva indicou que estas células são CNCC pós-migratórias que não podem ser estratificadas por E9.5.
Nossos dados sugerem que a regulação molecular de AJ por SPECC1L é mediada pela sinalização PI3K-AKT.A sinalização de AKT é reduzida em células e tecidos deficientes em SPECC1L.Achados de Fantauzzo et al.apoiam um papel direto para a sinalização PI3K-AKT na morfogênese craniofacial.(2014) mostraram que a falta de ativação da sinalização PI3K-AKT baseada em PDGFRα leva a um fenótipo de fenda palatina.Mostramos também que a inibição da via PI3K-AKT é suficiente para alterar o AJ e a forma celular nas células U2OS.Consistente com nossos achados, Cain et al.37 mostraram que a regulação negativa da subunidade PI3K α110 nas células endoteliais resulta num aumento semelhante na coloração de β-catenina pericelular, referido como um aumento no “índice de conectividade”.No entanto, em células endoteliais cujos filamentos de actina já estão altamente organizados, a supressão da via PI3K-AKT resulta numa forma celular frouxa.Em contraste, as células SPECC1L-kd U2OS mostraram uma forma celular alongada.Esta diferença pode ser específica do tipo de célula.Embora a supressão da sinalização PI3K-AKT afete permanentemente o citoesqueleto de actina, o efeito na forma da célula é determinado por alterações na tensão causadas por alterações na densidade e organização das fibras centrais de actina.Nas células U2OS, usamos apenas alterações na forma celular como marcador de alteração e recuperação de AJ deficiente em SPECC1L.Em conclusão, levantamos a hipótese de que a inibição da via AKT na deficiência de SPECC1L aumenta a estabilidade do AJ e reduz a delaminação no CNCC.
Curiosamente, os níveis de pan-AKT foram reduzidos in vitro e in vivo, além dos níveis de 473-AKT fosforilados na ausência de SPECC1L, sugerindo regulação da sinalização PI3K-AKT ao nível da estabilidade ou renovação da proteína AKT.Os genes SPECC1L e MID1, ambos associados à síndrome de Opitz/GBBB, codificam proteínas que estabilizam os microtúbulos 18,22 .O mecanismo pelo qual SPECC1L e MID1 medeiam a estabilização dos microtúbulos não é totalmente compreendido.No caso do SPECC1L, esta estabilização inclui acetilação aumentada de um subconjunto de microtúbulos 18.É possível que o SPECC1L utilize um mecanismo semelhante para estabilizar outras proteínas como a AKT.Foi demonstrado que a acetilação de resíduos de lisina na proteína AKT leva a uma diminuição na localização e fosforilação da membrana .Além disso, a ubiquitinação da cadeia K63 no mesmo resíduo de lisina na AKT é necessária para a sua localização e ativação na membrana .Entre vários fatores que interagem com proteínas SPECC1L identificadas em várias telas de dois híbridos de levedura de alto rendimento, quatro - CCDC841, ECM2942, APC e UBE2I43 - foram implicados na renovação ou estabilidade de proteínas via ubiquitinação ou sumoilação.O SPECC1L pode estar envolvido na modificação pós-tradução dos resíduos de lisina da AKT, afetando a estabilidade da AKT.No entanto, o papel crítico do SPECC1L na localização e estabilidade da proteína AKT continua por elucidar.
Defeitos graves na expressão de SPECC1L in vivo resultaram em aumento da coloração do marcador AJ e sobreposição defeituosa do CNCC, bem como aumento da apoptose e letalidade embrionária precoce.Relatórios anteriores mostraram que mutantes de camundongos com níveis aumentados de apoptose estão associados a defeitos do tubo neural 44,45,46,47 e defeitos craniofaciais .Tem sido sugerido que a morte celular excessiva nas pregas neurais ou nos arcos faríngeos pode resultar em um número insuficiente de células necessárias para o movimento morfogenético adequado 48,49,50.Em contraste, as nossas linhas celulares deficientes em SPECC1L com expressão de SPECC1L moderadamente reduzida mostraram apenas alterações de AJ sem evidência de aumento da morte celular.No entanto, a inibição química da via PI3K-AKT nestas células Kd resultou num aumento da apoptose.Assim, uma diminuição moderada na expressão ou função de SPECC1L garante a sobrevivência celular.Isto é consistente com a observação de que raros embriões mutantes Specc11 que escapam à prisão em st.E9.5 - talvez devido à redução da eficiência de captura de genes - são capazes de fechar seus tubos neurais e parar mais tarde no desenvolvimento, muitas vezes com defeitos craniofaciais (Fig. S3).Também consistente com isso é a rara ocorrência de embriões Specc1l heterozigotos com anormalidades craniofaciais - provavelmente devido ao aumento da eficiência de captura de genes - bem como a descoberta no peixe-zebra em que um dos dois ortólogos SPECC1L (specc1lb) causa fenótipos embrionários tardios, incluindo perda de maxilares inferiores e fissuras bilaterais51.Assim, mutações heterozigóticas de perda de função do SPECC1L identificadas em pacientes humanos podem causar pequenos prejuízos na função do SPECC1L durante a morfogênese craniofacial, suficientes para explicar suas fissuras orofaciais.A regulação de contatos intercelulares baseada em SPECC1L também pode desempenhar um papel na palatogênese e na fusão dos arcos faríngeos.Estudos adicionais da função SPECC1L ajudarão a elucidar o papel dos contatos intercelulares temporários no CNCC durante o fechamento do tubo neural na motilidade das células neuroepiteliais e na morfogênese craniofacial.
O controle do osteossarcoma U2OS e células SPECC1L-kd foram descritos anteriormente (Saadi et al., 2011).Anticorpos contra SPECC1L também foram caracterizados anteriormente (Saadi et al., 2011).Anticorpos anti-β-catenina (coelho; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (camundongo; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miosina IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-caderina (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colorado), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Califórnia), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). ), KI67 (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), caspase 3 clivada (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) e β-actina (1: 2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi usado conforme descrito..Os filamentos de actina foram corados com rodamina faloidina Acti-stain (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Células de controle U2OS e células SPECC1L-kd foram cultivadas em DMEM padrão com alto teor de glicose suplementado com 10% de soro bovino fetal (Life Technologies, Carlsbad, CA).Para alterações de AJ, 2 x 105 células foram semeadas em vidro tratado com gelatina suína a 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e observadas quanto a alterações na forma das células.As células foram coletadas em diferentes momentos indicados: 4 horas após a semeadura (t = 1), 24 horas após a semeadura (t = 2), confluência sem alteração no formato celular (t = 3), alteração no formato celular (t = 4) , 24 horas após a mudança na forma da célula (t = 5) e 48 horas após a mudança na forma da célula (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Para modular a via PI3K-AKT, as células foram cultivadas nas concentrações indicadas com o inibidor PI3K-AKT wortmanina (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) ou ativador SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).O meio contendo os produtos químicos foi trocado diariamente.
Gravações quadro a quadro foram feitas em controle ao vivo e células KD sob condições normais de cultura, e imagens de contraste de fase foram coletadas a cada 10 minutos durante 7 dias.As imagens foram adquiridas usando um microscópio invertido Leica DM IRB controlado por computador, equipado com uma platina mecânica e uma objetiva 10 × N-PLAN conectada a uma câmera QImaging Retiga-SRV.Durante a imagiologia, as culturas celulares foram mantidas a 37°C numa atmosfera húmida com 5% de CO2.
Duas linhas de células ES de armadilha genética DTM096 e RRH048 do Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) foram usadas para gerar linhas de camundongos deficientes em Specc11, designadas Specc1lgtDTM096 e Specc1lgtRRH046.Resumidamente, células 129/REJ ES foram injetadas em blastocistos C57BL6.Os camundongos machos quiméricos resultantes foram cruzados com camundongos fêmeas C57BL6 para identificar descendentes com coloração de pelagem agouti.A presença de inserções de vetores de armadilha genética foi usada para identificar heterozigotos.Os ratos foram mantidos num fundo misto de 129/REJ;C57BL6.A localização do sítio de inserção do vetor armadilha genética foi confirmada por RT-PCR, sequenciamento do genoma e complementação genética (Figura 1 suplementar).Para rastrear a linhagem CNCC de camundongos Specc1lGT duplamente heterozigotos, camundongos ROSAmTmG (#007576) e Wnt1-Cre (#003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram cruzados para produzir o alelo ROSAmTmG e Wnt1-Cre em embriões mutantes Specc1l.Todos os experimentos em camundongos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade de Kansas.
Os embriões foram fixados em (formaldeído a 1%, glutaraldeído a 0,2%, MgCl2 2 mM, NP-40 a 0,02%, EGTA 5 mM) durante 60 min à temperatura ambiente.Após fixação em solução de coloração X-gal (ferricianeto de potássio 5 mM, ferrocianeto de potássio 5 mM, MgCl2 2 mM, desoxicolato de sódio 0,01%, NP-40 0,02%, 1 mg/ml X-gal) o desenvolvimento da coloração foi realizado a 37°C. .°C dentro de 1-6 horas.Os embriões foram pós-fixados em PFA a 4% e visualizados.
Para Western blotting, as células foram lisadas em tampão de lise passivo (Promega, Fitchburg, WI) suplementado com uma mistura de inibidores de protease HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Os lisados ​​​​foram processados ​​​​em géis prontos Mini-PROTEAN TGX de poliacrilamida a 12% (Bio-Rad, Hercules, CA) e transferidos para membranas Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).As membranas foram bloqueadas em leite a 5% em PBS contendo Tween a 0,1%.Os anticorpos foram incubados durante a noite a 4°C ou durante uma hora à temperatura ambiente.O reagente Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) foi utilizado para geração de sinal.Para imunocoloração, os embriões foram fixados durante a noite em PFA/PBS a 4% e criopreservados.As criosecções de tecido foram bloqueadas em PBS contendo 1% de soro de cabra normal (Thermo Scientific, Waltham, MA) e 0,1% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e depois incubadas a 4°C numa incubadora durante o noite.com anti-anticorpo e anticorpo secundário fluorescente (1:1000) durante 1 hora a 4°C.As secções coradas foram colocadas em meio de ouro ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) e as imagens planas foram obtidas utilizando um microscópio confocal Leica TCS SPE.Cada imunocoloração foi realizada como três experimentos independentes em cirossecções de pelo menos dois embriões mutantes.Um experimento representativo é mostrado.
As células foram incubadas em tampão RIPA modificado (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NP-40 a 1%, NaCl 130 mM, glicerol a 10%, EDTA 2 mM e inibidor de protease HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Resumidamente, os lisados ​​foram pré-purificados com esferas magnéticas de proteína G (Life Technologies, Carlsbad, CA) e depois incubados durante a noite a 4°C. com anti-SPECC1L ou proteína IgG. Esferas de proteína G foram usadas para extrair SPECC1L e Western blotting foi realizado usando o anti-SPECC1L. Anticorpo -β-catenina descrito acima As experiências co-IP mostradas são representativas de quatro experiências independentes.
Células cultivadas fixas ou tecidos embrionários de camundongo foram fornecidos ao centro de microscopia eletrônica do Centro Médico da Universidade de Kansas.Resumidamente, as amostras foram incorporadas em resina EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polimerizadas durante a noite a 60 ° C e seccionadas a 80 nm utilizando um ultramicrótomo Leica UC7 equipado com uma lâmina de diamante.As seções foram visualizadas usando um microscópio eletrônico de transmissão JEOL JEM-1400 equipado com uma pistola Lab6 de 100 kV.
Como citar este artigo: Wilson, NR et al.A deficiência de SPECC1L leva ao aumento da estabilidade das articulações emendadas e à redução da delaminação das células da crista neural craniana.a ciência.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
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