Componente químico de tubo espiralado de aço inoxidável 347, identificação de novas proteínas acompanhantes de antígeno leucocitário humano-A (HLA-A) responsivas a interferon usando espectrometria de massa reticulada (CLMS)

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Descrição do produto

Tubos de bobina de aço inoxidável 347L, grau de aço: SS347L

O sistema de sinalização do interferon induz uma forte resposta de citocinas a uma ampla gama de sinais patogênicos e patológicos intrínsecos do ambiente, resultando na indução de subconjuntos de proteínas induzíveis por interferon.Aplicamos espectrometria de massa de ligação cruzada mediada por DSS (CLMS) para detectar novas interações proteína-proteína no domínio de proteínas induzidas por interferon.Além das proteínas indutíveis por interferon esperadas, também identificamos novos adutos reticulados intermoleculares e intramoleculares de proteínas canônicas induzíveis por interferon, como MX1, USP18, OAS3 e STAT1.Nós nos concentramos na validação ortogonal de um novo conjunto de redes de proteínas induzíveis por interferon formadas por proteínas HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) usando co-imunoprecipitação e seu estudo adicional usando modelagem de dinâmica molecular.A modelagem da dinâmica conformacional do complexo proteico revelou vários locais de interação que refletiam as interações identificadas nas descobertas do CLMS.Juntos, apresentamos um estudo piloto de CLMS para identificar novos complexos de sinalização induzidos por interferon, e esperamos o uso mais amplo de CLMS para identificar novas dinâmicas de interações proteicas no microambiente tumoral.
Antes de uma resposta imune adaptativa começar, o sistema de defesa inato do hospedeiro monta uma resposta antimicrobiana mediada por uma família de citocinas alfa-helicoidais secretadas chamadas interferons (IFNs).As classes IFN tipo I IFNα e IFNβ ativam respostas celulares, incluindo estados antivirais, pró-apoptóticos, pró-inflamatórios e antiproliferativos.Em humanos, são conhecidos 13 subtipos de IFNα, todos agrupados no cromossomo 91. Surpreendentemente, apenas o IFNα2 foi estudado para uso clínico.Recentemente, foi dada especial atenção à investigação de outros subtipos de IFNα.Um estudo recente mostrou que o IFNα14 é uma das isoformas mais eficazes na restrição da replicação do HBV2 e do HIV-13,4 em comparação com o subtipo canônico do IFNα2.
Foi estabelecido que os complexos receptores de interferon tipo I ativados (IFNAR1 e IFNAR2) desencadeiam uma cascata de transdução de sinal mediada pelas Janus quinases TYK2 e JAK15,6.Estas Janus quinases fosforilam transdutores de sinal e ativadores de proteínas transcricionais (STAT1 e STAT2) em resíduos de tirosina para iniciar a heterodimerização mediada pelo domínio SH2 .Posteriormente, o IRF9 liga-se aos heterodímeros STAT para formar um complexo trimérico do gene do fator 3 estimulado por IFN (ISGF3), que se transloca para o núcleo e induz a transcrição de mais de 2.000 genes estimulados por interferon (ISGs) .
Os ISGs formam a espinha dorsal do sistema imunológico inato, especialmente em resposta ao ataque viral.Como primeira linha de defesa contra infecções virais, as células implantam rapidamente extensas interações de proteínas celulares com uma ampla gama de atividades biológicas.Essas proteínas incluem receptores de reconhecimento de padrões, moléculas sinalizadoras, fatores de transcrição e proteínas com funções antivirais diretas, bem como reguladores negativos das respostas imunes9.Muitas das informações sobre a atividade de ISG vêm de telas funcionais usando telas de superexpressão10,11 ou técnicas de silenciamento de genes (siRNA, RNAi e CRISPR)12,13 nas quais ISGs individuais são expressos ou inibidos e sua atividade é testada em vários vírus.Embora estes estudos tenham determinado as propriedades antivirais de ISGs individuais, os mecanismos moleculares subjacentes de cada ISG permanecem em grande parte desconhecidos.É geralmente aceito que muitas proteínas interagem com uma ou mais citocinas para garantir atividade total, de modo que os ISGs interagem diretamente ou suas interações são mediadas por proteínas celulares.Por exemplo, um recente estudo proteômico fotoreticulado identificou ATPase VCP/p97 como um importante parceiro de interação IFITM3, cuja inibição leva a defeitos na classificação lisossômica, renovação e cotransporte de IFITM3 com partículas virais 14.Utilizando imunoprecipitação, identificamos VAPA, uma proteína associada a vesículas, como parceira de interação com IFITM1/2/3 que medeia a maturação viral mediada por colesterol, e isso foi confirmado por outro estudo utilizando um sistema de dois híbridos de levedura.Apoio Científico 15 , 16 .
Um processo biológico fundamental envolvido na supressão da infecção e da transformação maligna é a apresentação de antígenos, que é mediada por moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC).Peptídeos (8-12 aminoácidos de comprimento) de proteínas clivadas, terminadas prematuramente ou mal dobradas são carregados no heterodímero MHC-I (consistindo de cadeias pesadas e leves de MHC-I, chamadas β-2-microglobulina; β2M) 17,18.Os trímeros estáveis ​​do MHC-I resultantes são transportados para a superfície celular, onde apresentam peptídeos intracelulares às células T CD8+ (células T citotóxicas)17.As células T reconhecem e destroem esses patógenos e células que transportam um antígeno específico do tumor.Consequentemente, os patógenos e as células tumorais muitas vezes suprimem o processo de apresentação de antígenos para evitar a vigilância imunológica.Além disso, o MHC-I é regulado negativamente em 40-90% dos tumores humanos e está frequentemente associado a um pior prognóstico19.
Os genes envolvidos na resposta aos patógenos devem alternar rapidamente entre um estado de repouso e um estado de transcrição ativa.Portanto, supõe-se que várias proteínas celulares estejam envolvidas na resposta à alta demanda de IFN em curtos períodos de tempo, incluindo remodelação e modificação da cromatina promotora 20,21.A maioria dos estudos concentrou-se na identificação de parceiros individuais de proteínas ISG na presença de IFN.Vários estudos proteômicos e transcriptômicos em sistemas celulares modelo elucidaram o efeito do IFN na paisagem celular.No entanto, apesar de uma compreensão crescente da dinâmica induzida pelos interferões, ainda sabemos pouco sobre o envolvimento dos ISGs.Ao considerar a complexidade e a dinâmica dependente do tempo da sinalização do interferon, surgem duas questões: (i) é possível estabilizar e capturar os complexos multiproteicos envolvidos na sinalização rápida, e (ii) essas interações podem ser mapeadas no espaço 3D?
Para resolver essas questões, implementamos a reticulação química mediada por suberato de disuccinimida (DSS) acoplada à espectrometria de massa (CLMS) para estudar a rede de interação proteica induzida por IFNα e sua dinâmica.DSS adiciona ligações covalentes entre resíduos proximais de proteínas e/ou complexos proteicos in vivo.A análise subsequente de MS revela locais específicos de reticulação que refletem a proximidade espacial de regiões dentro de uma proteína específica, chamadas ligações internas, ou subunidades em complexos proteicos, chamadas inter-relações.Usando esta abordagem, identificamos vários novos complexos proteína-proteína, bem como redes de interação multiproteica induzidas por interferon.Testando ainda mais um subconjunto dessas novas interações, demonstramos que o H2BFS (FS do tipo histona H2B; doravante denominado H2B) e o MDN1 atuam como parceiros de ligação para o HLA-A.
As células Flo-1 são um dos modelos in vitro mais conhecidos de adenocarcinoma esofágico, pois imitam características-chave dos tumores esofágicos22,23.No entanto, nem todos os tumores são imunogénicos e para determinar se as células Flo-1 respondem ao tratamento com interferão, tratamos células Flo-1 com 10 ng/ml de IFNα durante 72 horas.As células Flo-1 mostraram indução precoce de pSTAT1 e IRF1, começando 2 horas após o tratamento e continuando por 72 horas, com uma diminuição dependente do tempo nos níveis estacionários de IRF1 (Figura 1A).Descobriu-se que os ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2 e ISG15) foram fortemente induzidos após 6 horas, imitando as respostas clássicas de fase média e tardia ao IFNα (Figura 1A).Juntos, estes dados sugerem que este modelo celular pode ser usado para estudar respostas de interferon.
Respostas diferenciais de expressão proteica em células Flo-1 após tratamento com IFNα.(A) A expressão proteica em células Flo-1 tratadas com 10 ng/ml de IFNα durante 2, 6, 24, 48 e 72 horas foi analisada por imunotransferência utilizando os anticorpos ISG indicados.(B) Géis SDS-PAGE corados com azul de Coomassie de extratos de células inteiras após reticulação com DSS para tempos e concentrações indicados.(C) Imunotransferência representativa examinada com anticorpo p53(DO-1) das mesmas amostras para avaliar o grau de reticulação da proteína.
Para capturar o cenário de interação proteica in situ, utilizamos DSS, um agente de reticulação amplamente utilizado devido à sua alta permeabilidade da membrana e tempo de reação relativamente curto.O tempo de reação mais curto ajuda a prevenir a formação de grandes agregados de proteínas reticuladas, mantendo assim a estabilidade do reticulador.Para determinar a concentração ideal de DSS e evitar reticulação excessiva, primeiro expusemos as células a 5, 2,5 e 1 mM de DSS por 5, 10, 5 e 30 minutos, respectivamente, e analisamos os lisados ​​por SDS-PAGE corado com Coomassie (dados não mostrados) .Os lisados ​​​​celulares parecem estar altamente reticulados na concentração mais baixa e no tempo mais curto.Portanto, o DSS foi titulado para 1, 0,5 e 0,1 mM durante 5 minutos (Figura 1B).A reticulação ideal foi observada com DSS 0,5 mM durante 5 minutos, e estas condições foram escolhidas para células tratadas com IFNα.Além disso, a Figura 1C mostra um Western blot realizado utilizando o anticorpo p53 (DO-1) para avaliar o grau de reticulação da proteína.
As células Flo-1 foram tratadas com 10 ng/ml de IFNα durante 24 horas antes da adição do reticulador.As células reticuladas foram subsequentemente lisadas por proteólise em duas etapas e as proteínas foram processadas por FASP (Fig. 2) .Os péptidos trípticos reticulados foram analisados ​​por espectrometria de massa (Fig. 2).Os espectros MS/MS são então combinados com a sequência da proteína e quantificados com MaxQuant26,27.Os peptídeos reticulados foram identificados a partir dos espectros obtidos usando o programa SIM-XL, e os compostos individuais foram combinados em uma rede complexa usando os pipelines de software de computação de código aberto xQuest28 e SIM-XL29 (Fig. 2).O SIM-XL identifica interações proteína-proteína, cadeias internas e cadeias individuais em misturas de proteínas simples ou complexas e fornece scripts para visualizar interações em estruturas proteicas.Além disso, classifica cada referência cruzada como uma pontuação ID de acordo com a qualidade do espectro MS/MS29.Várias interações e complexos proteína-proteína altamente confiáveis ​​​​foram identificados, e um novo conjunto de interações foi investigado posteriormente usando co-imunoprecipitação e mudanças conformacionais de complexos usando modelagem de dinâmica molecular (MD) (Fig. 2) 30, 31.
Visão geral esquemática do método CLMS.As células Flo-1 foram tratadas com 10 ng/ml de IFNα durante 24 horas seguido de reticulação de proteínas in situ utilizando DSS seguida de lise celular e tripsinização.Amostras reticuladas foram analisadas usando um espectrômetro de massa Orbitrap e posteriormente amostradas para fragmentação de precursores peptídicos durante LC-MS/MS.Dois peptídeos ligados foram identificados a partir dos espectros obtidos usando o programa Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL), e todos os compostos foram combinados em uma rede complexa usando pipelines computacionais.Filtre interações de baixa confiança com base em pontuações de taxa de falsos positivos (FDR).Várias novas interações proteína-proteína de alta fidelidade foram confirmadas usando co-imunoprecipitação, e mudanças conformacionais nos complexos foram examinadas usando modelagem de dinâmica molecular (MD).
Um total de ~ 30.500 e ~ 28.500 peptídeos foram detectados usando MaxQuant em amostras de IFNα não estimuladas e estimuladas, respectivamente (Tabela Suplementar S1, Fig. 3A).A distribuição do comprimento dos peptídeos em ambos os casos mostrou uma proporção maior de peptídeos maiores, indicando a presença de peptídeos reticulados (Fig. 3B, C).Além disso, uma proporção maior de peptídeos maiores estava presente na faixa de 40 a 55 em amostras tratadas com IFNα (Fig. 3C).O mapeamento de proteínas contra a intensidade log2 mostrou que as proteínas clássicas estimuladas por interferon foram as mais abundantes em comparação com amostras não tratadas, incluindo MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 e HLA-F (Figura 3D).A análise de vias para proteínas mais de três vezes enriquecidas em resposta ao tratamento com IFNα usando o banco de dados da via Reactome mostrou que a apresentação e processamento de antígeno mediado por MHC-I era a via mais dominante (Figura 3E).Consistente com relatos anteriores, as respostas antivirais mediadas por OAS e ISG15, bem como a sinalização de IFNα/β e citocinas estavam entre as vias ativadas.Além disso, foram identificadas ligações cruzadas de proteínas específicas de lisina e serina a partir dos espectros MS/MS originalmente adquiridos usando SIM-XL.Um estudo recente relatou 104 ISGs abrangendo 20 vírus de 9 classes de vírus por meta-análise de estudos individuais de superexpressão de ISG em 5 tipos de células9.No entanto, para superar as limitações computacionais da triagem de grandes conjuntos de dados, começamos com um conjunto de dados menor para explorar possíveis interações entre a lista de genes IRDS relatada por Padaria et al., a maioria dos quais são ISGs.
Identificação de proteínas reticuladas diferencialmente expressas em resposta ao IFNα (dados obtidos de MaxQuant).(A) Diagrama de Venn representando o número de peptídeos comuns e exclusivos identificados em amostras Flo-1 tratadas e não tratadas com IFNα14.Distribuição do comprimento dos peptídeos de amostras reticuladas não tratadas (B) e tratadas com IFNα (C).(D) Mapa de calor representando log2 (intensidade LFQ) entre células Flo-1 não tratadas e tratadas com IFNα14.O painel esquerdo mostra as proteínas mais activamente activadas na presença de IFNα.(E) Histograma representando as 20 principais vias de enriquecimento após tratamento com IFNα.O banco de dados da via Reactome analisou alterações de mais de quatro vezes nas proteínas responsivas ao IFNα reguladas positivamente.
A estimulação ISG mediada por interferon está bem documentada, mas no nível molecular é pouco compreendido como essas proteínas culminam em uma ampla gama de funções biológicas.Nós investigamos interações proteicas com um alto grau de confiança entre ISGs conhecidos.Curiosamente, identificamos uma rede incluindo proteínas MX1, USP18, ROBO1, OAS3 e STAT1 que formam um grande complexo em resposta ao tratamento com IFNα (Figura 4, Tabela S2) 32,33,34.Mais importante ainda, estas interações foram encontradas em todas as triplicatas tratadas com IFNα e não foram encontradas em amostras não tratadas, sugerindo que foram formadas especificamente em resposta ao tratamento com IFNα.Sabe-se que o STAT1 regula transcricionalmente a expressão destes ISGs, mas a sua interação com ISGs ao nível proteico não foi estudada.A estrutura cristalina do STAT1 mostrou que seu domínio helicoidal (CCD) não está envolvido na interação com DNA ou protômeros durante a formação de dímeros .Essas hélices α formam uma estrutura em hélice helicoidal que fornece uma área de superfície predominantemente hidrofílica para que ocorram interações 35 .Em nossos dados CLMS, observamos que a maioria das interações com STAT1 ocorreu no domínio SH2 precedendo o CCD, o domínio ligante ou a cauda C-terminal (resíduos 700-708) (Figura 4A).Um estudo anterior relatou que o USP18 se liga ao CCD e ao domínio de ligação ao DNA (DBD) do STAT2 e é recrutado para a subunidade do receptor de interferon tipo I IFNAR2 para mediar a inibição da sinalização do interferon tipo I 24 .Nossos dados também mostraram que o domínio catalítico USP18 interage com STAT1 DBD (Figura 4A,D), sugerindo que tanto STAT1 quanto STAT2 podem desempenhar um papel na atração de USP18 para IFNAR2.
Rede ISG proteína-proteína identificada em células reticuladas tratadas com IFNα.(A) Gráfico de interação 2D mostrando interações proteína-proteína (geradas no programa SIM-XL), com linhas representando interações intermoleculares (ponto de corte de ligação cruzada definido como 3,5).Domínios de diferentes identidades são marcados por sua cor32: domínio MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) e GED (569–660).Domínios OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) e OAS1_C (903-108).Domínio ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) e fn3 (777–864).Campos STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) e STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Visualizador circular de proteínas reticuladas (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 e STAT1) com interações e interações marcadas em azul e vermelho, respectivamente.O limite de ligação cruzada foi definido em 3,5.Os gráficos de pontos indicam locais de interação STAT1 com MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) e OAS3 (F), bem como locais de interação K ou S entre os dois peptídeos.Na figura, o limite de pontuação de cross-link é definido como 3,0.(G) Vários locais de interação entre os domínios DI STAT1 e OAS3 sobrepostos às suas estruturas proteicas em PyMol (sistema gráfico molecular PyMOL, versão 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (id do pdb: 1bf533) e OAS3 (id do pdb: 4s3n34).) programa.
Duas isoformas de USP18 foram descritas em humanos, uma proteína de comprimento total que está predominantemente localizada no núcleo, e uma isoforma sem domínio N-terminal, USP18-sf, que está distribuída uniformemente no citoplasma e no núcleo 36 .Além disso, prevê-se que o terminal N seja não estruturado e não requer atividade de isopeptidase ou ligação a ISG1537.A maioria das interações identificadas em nosso estudo estavam localizadas no terminal N da proteína, sugerindo que essas interações envolvem USP18 completo (Figura 4A,D) e, portanto, provavelmente ocorrem no núcleo.Além disso, nossos dados também indicam que o terminal N é especializado em interações proteína-proteína.O sítio de ligação do IFNAR2 está localizado entre os resíduos 312-368 e, notavelmente, nenhuma das proteínas do complexo se liga a esta região (Fig. 4A) 37,38.Estes dados tomados em conjunto indicam que o domínio de ligação ao IFNAR2 é utilizado exclusivamente pela proteína receptora.Além disso, apenas OAS3 e ROBO1 foram associados a domínios a montante do terminal N e do local de ligação do IFNAR2 (Figura 4A).
ROBO1 pertence à superfamília de imunoglobulinas (Ig) de moléculas de sinalização transmembrana e consiste em cinco domínios Ig e três domínios de fibronectina (Fn) na região extracelular.Esses domínios extracelulares são seguidos por uma região proximal à membrana e uma única hélice transmembrana 39. Uma região intracelular não estruturada está localizada no terminal C e contém motivos de sequência conservados que medeiam a ligação à proteína efetora .A região que se estende dos aminoácidos ~1100 a 1600 está principalmente desordenada.Descobrimos que MX1 interage com ROBO1 através de Ig, Fn e domínios intracelulares, enquanto a maioria das interações com STAT1 ocorre entre seu CCD, domínio ligante e o terminal C de ROBO1 (Fig. 4A, E).Por outro lado, as interações com as regiões ligantes DI, DIII e OAS3 foram distribuídas por toda a proteína ROBO1 (Fig. 4A).
A família de proteínas oligoadenilato sintase (OAS) aceita e se liga ao RNA de fita dupla intracelular (dsRNA), sofre alterações conformacionais e sintetiza oligoadenilatos ligados em 2', 5' (2-5 As) 40 .Verificou-se que entre os três OAS, o OAS3 apresenta a maior afinidade por dsRNA e sintetiza a menor quantidade de 2-5 As, o que pode ativar a RNase L e, assim, limitar a replicação viral 41 .A família OAS consiste em domínios de nucleotídeo transferase semelhantes à polimerase beta (pol-β).Pesquisas anteriores mostraram que a atividade catalítica do domínio C-terminal (DIII) é dependente do domínio de ligação ao dsRNA (DI), que é necessário para a ativação do OAS342.Observamos que os domínios DI e DII do OAS3 interagem com o CCD e uma pequena região de junção entre SH2 e STAT1 TAD (Figura 4A,F).A sobreposição de diferentes locais de reticulação na estrutura da proteína revelou uma interação entre a folha β e a alça DBD STAT1 e uma bolsa ou cavidade aberta formada pelos resíduos 60-75 no domínio DI de OAS3 (Fig. 4G).A orientação das proteínas no complexo também indicou que nenhuma das interações com OAS3 interferiu na capacidade de ligação ao DNA do seu domínio DI (Fig. S1A).Além disso, o domínio N-terminal da GTPase MX1 interage extensivamente com os domínios DI e DIII do OAS3 (Fig. 4A).Também observamos uma interação entre OAS1 e MX1 em todas as três repetições tratadas com IFNα, onde um único domínio OAS1 (também cataliticamente ativo) interagiu com todos os três domínios MX1 (Figura S2A, B).
As proteínas MX fazem parte de uma grande família de GTPases semelhantes à dineína que contêm um domínio GTPase N-terminal que se liga e hidrolisa GTP, um domínio intermediário que medeia a automontagem e um zíper de leucina C-terminal que atua como uma GTPase (LZ ).domínio domínio efetor25,43.MX1 liga-se a subunidades de polimerases virais para bloquear a transcrição do gene viral43.Uma triagem de dois híbridos de levedura relatada anteriormente mostrou que MX1 associado a PIAS1 inibe a ativação do gene mediada por STAT1 bloqueando a atividade de ligação ao DNA e também possui atividade de ligase SUMO E344,45.Aqui, demonstramos que MX1 se liga a STAT1 (Figura 4C,D), no entanto, como essa interação afeta a ativação do gene mediada por STAT1 em resposta ao IFNα precisa de mais estudos.Além disso, também descobrimos que MX1 interagiu com IFIT3 e DDX60 em todas as três repetições tratadas com IFNα (Fig. S2C).
DDX60 é uma helicase citoplasmática induzida por IFN que foi anteriormente relatada como desempenhando um papel na degradação independente de RIG-I do RNA viral .Ele interage com o RIG-I e ativa sua sinalização de maneira específica do ligante 46. DDX60 consiste em um domínio helicase DEXD/H-Box e um domínio helicase C-terminal que se liga ao RNA e DNA viral .A maioria de suas interações com MX1 e IFIT3 ocorre em longas regiões N e C-terminais sem domínios ou motivos canônicos (Fig. S2E, F).No entanto, MX1 também está associado ao domínio helicase DEXD/H-Box (Fig. S2E).As proteínas da família IFIT possuem cópias em tandem de um motivo hélice-volta-hélice distinto denominado repetição tetrapeptídica (TPR).Descobriu-se que o IFIT3 é um modulador positivo da sinalização RIG-I e, portanto, um componente do complexo MAVS.Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que o IFIT3 e o DDX60 interagem principalmente na região entre TPR 3–6 do IFIT3 e podem desempenhar um papel na sinalização RIG-I/MAVS (Fig. S2F).
Dado que o rastreio de todo o proteoma é computacionalmente intensivo, rastreamos então toda a base de dados UniProt humana quanto à presença de uma das repetições tratadas com IFNα.Nesta réplica, encontramos diversas redes de interação altamente confiáveis ​​para o HLA-A.A análise das vias proteicas identificadas pelos espectros MS/MS mostrou que o processamento e apresentação do antígeno baseado em MHC-I é a principal via induzida pelo interferon (Fig. 3D).Portanto, nos concentramos em estudar as interações proteicas das moléculas MHC-I com um alto grau de confiança em todas as amostras reticuladas.O HLA consiste em domínios α1, α2 e α3 e cadeias leves, e a microglobulina β2 (β2m) é uma proteína acompanhante constante49.Uma vez montado no retículo endoplasmático, o HLA é instável na ausência de ligantes peptídicos50.O sulco de ligação ao peptídeo é formado pelos domínios α1 e α2 altamente polimórficos e não estruturados na forma não peptídica e pelo domínio α351 relativamente menos polimórfico.Na presença de IFNα, detectamos dois complexos HLA-A: um interage com HMGA1 e H2B (Figura 5, Tabela S3) e o outro interage com MDN1, LRCH4 e H2B (Figura 6).
IFNα induz uma rede de interação HLA-A com H2B (H2BFS) e HMGA1.(A) Gráfico 2D (gerado no software SIM-XL) representando diferentes tipos de interações no complexo H2B-HLA-A-HMGA1: interligação (azul), interligação (vermelho) e ligação única (preto)..Domínios de diferentes identidades são codificados por cores: H2B (histona; 2–102) e MHC-I (MHC_1; 25–203, grupo C1; 210–290 e MHC_I_C; 337–364).O limite de ligação cruzada foi definido em 3,5.Os gráficos de pontos indicam locais de interação HLA-A com H2B (B) e HMGA1 (C), bem como locais de interação K ou S entre os dois peptídeos.Na figura, o limite de pontuação de cross-link é definido como 3,0.(D) Relações entre proteínas mostradas nas estruturas das proteínas H2B, HLA-A e HMGA1 no programa PyMOL.Essas estruturas foram modeladas usando o servidor Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) e as estruturas modelo para as proteínas H2B, HLA-A e HMGA1 foram 1kx552, 1kj349 e 2eze55, respectivamente.
IFNα induz uma rede de interação HLA-A com H2B (H2BFS), MDN1 e LRCH4.(A) Crosslinks intramoleculares (vermelho) e intermoleculares (azul) apresentados em um mapa interativo 2D (gerado no software SIM-XL) com MDN1 representado como um círculo.O limite de ligação cruzada foi definido em 3,5.Domínios de diferentes identidades são codificados por cores: H2B (histona; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grupo C1; 210–290 e MHC_I_C; 337–364) e LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) e CH (535–641)).(B) Relações entre proteínas mostradas nas estruturas das proteínas H2B, HLA-A, LRCH4 e MDN1 no programa PyMOL.Essas estruturas foram modeladas usando o servidor Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) com estruturas modelo 1kx552, 1kj349, 6hlu62 e 6i2665 para as proteínas H2B, HLA-A, LRCH4 e MDN1, respectivamente.Gráficos de pontos mostrando locais de interação K ou S para HLA-A com H2B (C), LRCH4 (D) e MDN1 (E).Para parcelas, o limite de pontuação de cross-link foi definido como 3,0.
Além de manter a integridade do genoma, a histona H2B também está envolvida na regulação da transcrição.A proteína H2B consiste em um domínio histona central (HFD) formado por três hélices α separadas por alças e uma cauda C-terminal 41,52.A maior parte da interação com H2B ocorre na hélice α1, que proporciona trimerização com o heterodímero HFD (Fig. 5A, B).Embora as lisinas estejam envolvidas na ligação ao DNA, algumas lisinas também são locais alternativos de acetilação ou metilação.Por exemplo, os resíduos K43, K46 e K57 de H2B não estão envolvidos na ligação direta ao DNA, mas são alvos de várias modificações pós-transcricionais53.Da mesma forma, os resíduos K44, K47 e K57 em H2B podem desempenhar um papel alternativo na presença de IFNα, incluindo interações com outras proteínas (Fig. 5A, B).Além disso, a histona extracromossômica H2B ativa a resposta imune em vários tipos de células, atuando como sensor citosólico para detectar fragmentos de DNA de fita dupla (dsDNA) derivados de agentes infecciosos ou células danificadas54.Na presença de vírus de DNA, a depleção de H2B inibiu a produção de IFN-β e a fosforilação de STAT154.Sabe-se também que o H2B entra e sai do núcleo mais rapidamente do que outras histonas centrais .Interações H2B com MDN1 e LRCH4 também foram observadas em amostras não tratadas selecionadas.Descobrimos que o HLA-A interagiu com o H2B em todas as três amostras tratadas com IFNα e em uma amostra repetida não tratada.Estes dados refletem o papel do H2B numa função fisiológica alternativa independente da regulação transcricional.
HMGA1 (grupo de alta mobilidade AT-Hook 1), uma pequena nucleoproteína rica em aminoácidos promotores de doenças, foi identificada em associação com HLA-A.Possui uma cauda C-terminal ácida e três DBDs distintos chamados ganchos AT porque se ligam ao sulco menor da região rica em AT no dsDNA55,56.Essa ligação faz com que o DNA se dobre ou se endireite, permitindo que fatores de transcrição canônicos acessem sua sequência de consenso.Acredita-se que a cauda C-terminal esteja envolvida nas interações proteína-proteína e no recrutamento de fatores de transcrição, uma vez que os mutantes de deleção C-terminal são incapazes de iniciar a transcrição .Além disso, este domínio contém vários sítios de fosforilação conservados que são substratos conhecidos para quinases 58.Observamos interações HLA-A e H2B com HMGA1 fora do domínio C-terminal, sugerindo que o domínio C-terminal é usado principalmente para ligação do fator de transcrição (Fig. 5A, C).As proteínas HMGA competem com a histona H1 pela ligação ao DNA adaptador, aumentando assim a acessibilidade .Da mesma forma, parece provável que o HMGA interaja com a histona H2B ao longo do DNA ligante em competição com a histona H1.HMGB1 induz a expressão de HLA-A, -B e -C em células dendríticas, levando à sua ativação , mas uma interação entre HMG e HLA não foi relatada anteriormente.Descobrimos que o HMGA1 interage com os domínios α1 e α3 do HLA-A, com a maioria das interações fora dos seus 3 DBD (Figura 5A,C).Em nossas mãos, descobriu-se que o HLA-A está localizado no núcleo (dados não mostrados), e dado que H2B e HMGA1 também estão presentes no núcleo, essa interação provavelmente ocorre no núcleo.Adutos específicos medidos entre H2B, HLA-A e HMGA1 são mostrados na Figura 5D.
A maioria das interações do HLA-A com outras proteínas ocorre dentro dos seus domínios α1 e α2 e no domínio C-terminal desordenado (Fig. 6).Em um desses exemplos, descobrimos que o HLA-A interage com a cauda N-terminal desordenada do LRCH4 (Figura 6A,D).O LRCH4 regula a ativação do TLR4 e a indução de citocinas LPS, modulando assim a resposta imune inata60,61.É uma proteína de membrana com nove repetições ricas em leucina (LRRs) e um motivo de homologia de calmodulina (CH) em seu ectodomínio, seguido por um domínio transmembrana (TMD) 60,62.Foi relatado que os domínios CH medeiam interações proteína-proteína 60 .Um trecho de cerca de 300 aminoácidos entre os domínios LRR e CH é relativamente acessível, mas desordenado.Com base na função das regiões desordenadas como mediadores de redes proteína-proteína e transporte vesicular 63, descobrimos que a maioria das interações proteicas ocorre em regiões desordenadas.As interações com MDN1 foram distribuídas por todo o comprimento da proteína, incluindo os domínios LRR1, LRR6, CH e regiões aleatórias, enquanto o H2B se ligou principalmente ao domínio CH (Fig. 6A, B).Notavelmente, nenhuma das interações incluiu a ATM, sugerindo a especificidade da abordagem CLMS (Figura 6A, B).
O MDN1 também foi identificado como parte da rede de proteínas HLA-A (Figura 6A).Pertence à família de proteínas AAA (ATPases associadas a diversas atividades).Este é o mesmo domínio AAA N-terminal que se organiza em um anel hexamérico e remove o fator de montagem da subunidade ribossômica 60S 64.parece ser semelhante à dineína64,65,66.Além disso, a região rica em Asp/Glu é seguida pelo domínio MIDAS (sítio dependente de íons metálicos).Devido ao grande tamanho do MDN1 (aproximadamente 5.600 aminoácidos) e sua homologia limitada com proteínas bem estudadas, pouco se sabe sobre sua estrutura e função em humanos.Identificamos HLA-A, H2B e LRCH4 como parceiros de ligação ao MDN1 e revelamos sua orientação como complexos proteicos em PyMol (Fig. 6A, B).Estas três proteínas interagem com o domínio AAA, o domínio ligante semelhante à dineína e possivelmente o domínio MIDAS MDN1.Num relatório anterior, a purificação por afinidade de proteínas de isca identificou MDN1 como uma proteína associada à histona H2B67.Além disso, um estudo recente também relatou uma interação entre MDN e HLA-B em células HCT116 usando espectrometria de massa purificada por afinidade, apoiando nossos achados .A identificação deste complexo em amostras tratadas com IFNα sugere um papel para o MDN1 na sinalização do interferon.
Como os genes HLA são altamente polimórficos, extraímos leituras de sequenciamento mapeando HLA-A, -B e -C a partir de dados de sequenciamento de RNA de células Flo-1 (dados não mostrados).Sequências peptídicas consistentes com a leitura de sequenciamento revelaram diferenças significativas entre HLA-A, -B e -C em regiões onde os peptídeos reticulados estavam localizados em HLA-A (Figura S3).Além disso, não observamos reticulação proteína-proteína de moléculas HLA-B/C com proteínas H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Isto sugere que a interação proteica encontrada entre HLA-A, MDN1, LRCH1 e HMGA1 é específica para HLA-A.Além disso, a análise proteômica de amostras não reticuladas (Tabela S4) mostrou que o HLA-A possui maior cobertura de sequência em comparação com HLA-B ou HLA-C.Os peptídeos identificados para HLA-A foram de alta intensidade tanto nas amostras tratadas como nas não tratadas com IFNα.
Para garantir que as interações aqui identificadas não foram devidas à ligação cruzada não específica de duas proteínas em estreita proximidade espacial, confirmamos ainda dois novos fatores de interação HLA-A realizando ensaios de co-imunoprecipitação.Interações HLA-A com MDN1 e H2B endógenos foram detectadas em células Flo-1 tratadas e não tratadas com IFNα (Figura 7, Figura S4).Confirmamos que o HLA-A foi capturado por H2B nos imunoprecipitados e que esta associação foi devida ao tratamento com IFNα, uma vez que o HLA-A estava ausente nas amostras de imunoprecipitado de células não tratadas (Figura 7A).No entanto, nossos dados sugerem que o IFNα regula diferencialmente a ligação do HLA-A ao H2B e ao MDN1.O IFNα induz associação entre H2B e HLA-A, mas reduz sua associação com MDN1.Descobrimos que o MDN1 estava associado ao HLA-A nos controles, e a adição de IFNα reduziu essa interação independente da indução do MDN1 pelo IFNα (Figura 7B,C).Além disso, a imunoprecipitação HLA-A capturou H2B em células A549 (Fig. S4), sugerindo que esta interação é independente do tipo de célula.Tomados em conjunto, estes resultados apoiam interações mediadas por interferon de HLA-A com H2B e MDN1.
HLA-A co-purifica H2B e MDN1.Imunotransferências endógenas representativas de H2B (A) e MDN1 (B) foram imunoprecipitadas a partir de células Flo-1 tratadas com IFNα e sondadas quanto aos anticorpos indicados.IgG de rato e coelho foram utilizados como controle negativo.(C) Quantidades relativas (entrada) de diferentes antígenos são representadas por imunotransferências sondadas contra anticorpos indicados, a β-actina foi usada como controle de carga.
As propriedades estruturais de uma das redes reticuladas altamente confiáveis ​​induzidas por interferon, H2B-HLA-A-HMGA1, foram investigadas.Utilizamos a modelagem de dinâmica molecular como uma abordagem alternativa para entender a dinâmica conformacional das proteínas envolvidas neste complexo (Figura 8).As inferências dos dados do CLMS sugerem a possibilidade de diferentes conformações das proteínas H2B, HLA-A e HMGA1.Portanto, os seguintes complexos potenciais foram modelados em meio solvente: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A e H2B-HLA-A-HMGA1.Uma tela inicial de acoplamento proteína-proteína usando o pacote MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canadá) sugeriu possíveis conformações que diferem entre essas proteínas (Fig. 8A).A visualização do complexo proteico de ancoragem revelou diversas interações e possíveis conformações (Figura 5A, 8).Assim, uma possível conformação é mostrada na Figura 8A (com ligações cruzadas rotuladas) e foi avaliada posteriormente usando o pipeline de modelagem MD.Além disso, a ligação de H2B ou HMGA1 ao HLA-A destaca a maior afinidade do H2B pelo HLA-A (Fig. 8A).
Dinâmica conformacional de possíveis redes entre os complexos H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A e H2B-HLA-A-HMGA1.(A) O painel esquerdo é um mapa 2D (gerado no software SIM-XL) de ligações cruzadas intramoleculares (vermelho) e intermoleculares (azul) (corte de ligação cruzada definido como 3,5).Além disso, os resíduos de reticulação identificados são marcados nas estruturas das proteínas H2B, HLA-A e HMGA1.As conformações associadas dessas proteínas foram extraídas usando o docking pipeline implementado no pacote MOE.O painel inferior esquerdo mostra as várias conformações possíveis dos complexos H2B-HLA-A e HMGA1-HLA-A com diferentes afinidades de ligação proteína-proteína (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Desvio padrão (RMSD) das posições atômicas (excluindo átomos de hidrogênio) para cada estrutura proteica.(C) Interações de ligações de hidrogênio proteína-proteína intermoleculares de vários complexos simulados considerando interações específicas de duração ≥ 10 ns.A distância de corte doador-aceitador da ligação h foi definida como 3,5 Å, e o ângulo de corte doador-aceitador H foi definido como ≥ 160°–180°.(D) Resíduos marcados formando interações proteína-proteína HLA-A com seus respectivos parceiros, abrangendo ≥ 20 ns, extraídos de complexos fictícios HLA-A-H2B e HLA-A-HMGA1.As estruturas proteicas representam uma estrutura média de 100 ns MDS.(E) Interações entre os complexos HLA-A-H2B e HLA-A-HMGA1 em comparação com interações rastreadas pela simulação H2B-HLA ao longo de 100 ns com base no sítio de interação K ou S entre os dois peptídeos.Complexos /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.O valor limite para a avaliação de ligações cruzadas foi definido como 3,0, e foram levadas em consideração interações específicas do MDS levando ≥ 10 ns.As estruturas proteicas foram visualizadas usando os pacotes BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, EUA) e Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canadá).
A estabilidade das moléculas HLA-A ao longo do tempo (desvio padrão; RMSD ou desvio padrão; RMSF) indicou que a presença de proteínas H2B ou HMGA1 nos complexos estabilizou o HLA-A (Figura 8B, Figura S5).A proteína HMGA1 liga-se firmemente ao sítio B2M do HLA-A, induzindo a estabilidade dos aminoácidos HLA-A no complexo HLA-A-HMGA1 ou H2B-HLA-A-HMGA1 (Figura 8B, Figura S5).em particular, descobriu-se que os resíduos HLA ~60-90 e ~180-210 eram menos flexíveis na presença de H2B (FIG. 8B).H2B e HMGA1 mostraram melhor ligação ao HLA-A no complexo H2B-HLA-A-HMGA1 em comparação com a ligação do HLA-A apenas ao H2B ou HMGA1 (Figura 8C, D; Tabela S5).Os resíduos envolvidos na ligação de hidrogênio (alta ocupação modelada por MD ≥ 10 ns) coincidem com os locais de interação CLMS (resíduos K ou S) no complexo, sugerindo que as interações identificadas pelo CLMS são muito confiáveis.Confiabilidade (Fig. 8E).Na modelagem CLMS e MD, descobriu-se que resíduos de HLA-A entre cerca de 190-210 e cerca de 200-220 aminoácidos se ligam a H2B e HMGA1, respectivamente (FIG. 8E).
As interações proteína-proteína formam redes estruturais dinâmicas que medeiam a comunicação intracelular em resposta a certos estímulos.Como muitas abordagens proteômicas detectam mudanças no nível geral de estado estacionário de uma proteína, a dinâmica da interação proteína-proteína requer ferramentas adicionais para capturar interfaces de ligação, e o CLMS é uma dessas ferramentas.O sistema de sinalização de interferon é uma rede de citocinas que permite que as células respondam a uma série de sinais patogênicos ambientais e patológicos intrínsecos, culminando na indução de subconjuntos de proteínas induzíveis por interferon.Aplicamos CLMS para determinar se novas interações proteína-proteína poderiam ser identificadas entre um painel de proteínas induzidas por interferon.A análise global de reticulação de proteínas em um modelo de células Flo-1 responsivo a interferon foi usada para capturar complexos proteicos.A extração de peptídeos trípticos de células não reticuladas e reticuladas permite a contagem de peptídeos, o enriquecimento da via e a distribuição do comprimento do peptídeo com intensidade LFQ definida.Proteínas indutíveis por interferon canônico foram identificadas como um controle interno positivo, enquanto novos adutos reticulados intermoleculares e intramoleculares de proteínas induzíveis por interferon canônico, como MX1, UP18, OAS3 e STAT1, foram observados.Várias características estruturais e interações em áreas funcionais foram investigadas.
Uma interação entre HLA-A, MDN1 e H2B foi detectada por imunotransferência em células Flo-1 e A549 tratadas e não tratadas com IFNα.Nossos resultados destacam que o HLA-A se complexa com o H2B de maneira dependente do IFNα.Nosso trabalho representa um caminho interessante para uma maior exploração da co-localização destes dois complexos.Também seria interessante expandir a abordagem CLMS para um painel de linhas celulares para identificar interações proteicas mediadas por interferon independentes do tipo de célula.Finalmente, utilizamos a modelagem MD como uma abordagem alternativa para entender a dinâmica conformacional das proteínas envolvidas no complexo H2BFS-HLA-A-HMGA1, que rastreou conversas cruzadas intramoleculares e intermoleculares.As inferências dos dados do CLMS sugerem a possibilidade de diferentes conformações das proteínas H2BFS, HLA-A e HMGA1.As possíveis diferentes conformações entre estes complexos de proteínas de acoplamento revelaram várias interações semelhantes às observadas no conjunto de dados CLMS.Um dos principais pontos fortes do nosso método é que ele permite a fácil identificação de genes altamente polimórficos em interação, como o HLA, por isso será interessante estudar interações de proteínas específicas do haplótipo HLA que, de outra forma, seriam difíceis de estudar.Tomados em conjunto, nossos dados demonstram que o CLMS pode ser usado para expandir nossa compreensão das redes de sinalização induzidas por interferon e fornecer uma base para o estudo de sistemas intercelulares mais complexos no microambiente tumoral.
As células Flo-1 foram obtidas da ATCC e mantidas em DMEM (Gibco) suplementado com 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen), 10% de soro fetal bovino (Gibco) e armazenadas a 37°C e 5% de CO2.Incubação.As células foram cultivadas até 70-80% de confluência antes de serem tratadas com IFNα14 (fabricado pela Edinburgh Protein Production Facility).Todos os outros produtos químicos e reagentes foram adquiridos da Sigma Aldrich, salvo indicação em contrário.
As células Flo-1 foram cultivadas em placas de 6 poços e no dia seguinte as células foram tratadas com 10 ng/ml de IFNα14 durante 24 horas até aproximadamente 80% de confluência.As células foram lavadas três vezes com PBS e ligadas com DSS recentemente preparado (Thermo Fisher Scientific) (dissolvido em DMSO) em PBS durante 5 min a 37°C até uma concentração final de 0,5 mM.A reação de reticulação de DSS foi substituída por PBS e o DSS residual foi extinto pela adição de Tris 20 mM (pH 8,0) em PBS durante 15 min a 37°C.As células foram coletadas por raspagem e coletadas em tubos de baixa ligação (Axygen).
O sedimento celular foi lisado com 300 µl de tampão de lise de ureia (ureia 8 M, Tris 0,1 M, pH 8,5) durante 30 min à temperatura ambiente com agitação ocasional.Todas as etapas de centrifugação foram realizadas a 14.000 xg a 8°C.Centrifugar o lisado durante 10 minutos e transferir o sobrenadante para um novo tubo.As partículas claras restantes foram dissolvidas em 150 μl do segundo tampão de lise (ureia 2 M, SDS (dodecilsulfato de sódio) 2% (p/v)) por 30 minutos ou mais até que uma solução aquosa homogênea fosse obtida.O lisado foi centrifugado durante 20 minutos e o sobrenadante foi misturado com o lisado obtido na etapa anterior.As concentrações de proteína foram avaliadas utilizando o ensaio Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante para procedimentos de microplacas.As amostras foram rapidamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C.
Aproximadamente 100 μg de proteína reticulada solúvel foram processados ​​usando um protocolo modificado de preparação de amostras de filtração (FASP), conforme descrito por Wisniewski et al.69 Resumidamente, a proteína é reticulada com 200 µl de tampão de ureia (ureia 8 M em Tris 0,1 M, pH 8,5), agitada em vórtice e dividida pela metade.Todas as etapas de centrifugação foram realizadas a 14.000 xg a 25°C.A primeira metade do lisado proteico reticulado foi transferida para um dispositivo de filtro centrífugo Microcon de 10 kDa equipado com uma membrana Ultracel-10 (Merck), seguido de centrifugação no filtro durante 25 minutos.Em seguida, adicione a segunda metade da proteína ao filtro e repita os mesmos passos.A recuperação proteica foi realizada adicionando 100 μl de cloridrato de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) 17 mM em tampão de ureia.A recuperação foi agitada num termomisturador a 600 rpm durante 30 min a 37°C.Além disso, a coluna foi centrifugada e a proteína reticulada reduzida foi alquilada utilizando 100 μl de iodoacetamida 50 mM em tampão de ureia.A reação de alquilação foi realizada à temperatura ambiente durante 20 minutos no escuro.Rodar a coluna, lavar as paredes da coluna 3 vezes com 100 µl de tampão de ureia e depois centrifugar.A mesma operação foi realizada 3 vezes utilizando 100 μl de bicarbonato de amônio 100 mM.Antes da tripsinização, substitua o tubo de coleta por um novo.Adicionar tampão de digestão contendo bicarbonato de amônio 50 mM e 1 μl de tripsina diluída em tampão de tripsina (Promega).A proporção de tripsina para proteína foi mantida em cerca de 1:33, e as reações de digestão foram incubadas durante a noite a 37°C em uma câmara úmida.O peptídeo reticulado foi eluído do filtro por centrifugação durante 25 minutos.A recuperação de peptídeos foi melhorada pela adição de 50 μl de NaCl 0,5 M ao filtro, seguido de centrifugação por 25 minutos.
Colunas C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) foram usadas para dessalinizar peptídeos trípticos reticulados seguindo o protocolo descrito por Bouchal et al.70 com pequenas modificações.Resumidamente, as colunas giratórias C18 foram ativadas com três lavagens de ácido fórmico (FA) a 0,1% em acetonitrila (AcN) (Merck) e duas lavagens de FA a 0,1%.A coluna foi hidratada com 0,1% de FA durante 15 minutos.Carregar amostras em colunas giratórias e lavar 3 vezes com 0,1% FA.Os peptídeos dessalinizados foram eluídos sequencialmente com um gradiente gradual usando 50%, 80% e 100% de AcN em 0,1% de FA.As amostras foram secas em concentrador SpeedVac Plus (Eppendorf) até o completo desaparecimento do líquido residual.Os péptidos eluídos foram dissolvidos em 100 μl de ácido trifluoroacético a 0, 08% em AcN2 a 2, 5% e as concentrações foram medidas num NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Aproximadamente 1 μg de peptídeo reticulado por amostra foi injetado no sistema LC-MS/MS.
Os péptidos reticulados foram separados num sistema UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) ligado a um espectrómetro de massa Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Os péptidos reticulados foram recolhidos numa coluna de captura C18 com pré-coluna µ de 300 µm de diâmetro e 5 mm de comprimento, embalada com sorvente C18 PepMap100 e sorvente PepMap de 5 µm (Thermo Scientific).Carregar o fluxo da bomba definido em 5 μl/min de ácido trifluoroacético a 0,08% dissolvido em 2,5% de AcN.Os peptídeos reticulados foram separados em uma coluna analítica de sílica fundida com diâmetro interno de 75 μm e comprimento de 150 mm, preenchida com um sorvente PepMap de 2 μm (Thermo Scientific).As fases móveis A e B consistiam em 0,1% de FA em água e 0,1% de FA em acetonitrila, respectivamente.O gradiente começa em 2,5% B e aumenta linearmente para 40% B ao longo de 90 minutos, depois para 90% B durante os próximos 2 minutos.A composição da fase móvel foi mantida a 90% de B durante 10 minutos e depois diminuiu linearmente para 2,5% de B durante 2 minutos.A coluna foi equilibrada a 2,5% de B durante 8 minutos antes do ciclo seguinte.Os péptidos reticulados eluídos da coluna analítica foram ionizados numa fonte de ionização por nanoelectrospray (NSI) e injectados num espectrómetro de massa Exploris 480 (Thermo Scientific).
O espectrômetro de massa Orbitrap Exploris 480 operou no modo de correlação positiva de dados.Uma varredura completa foi realizada no modo de seção com uma resolução de 120.000 com configurações de faixa de m/z 350 Th a m/z 2.000 Th.A meta normalizada do AGC foi definida em 300% com tempo máximo de entrada de 50ms.A detecção de pico monoisotópico foi estabelecida para peptídeos.O parâmetro de relaxamento de restrição é definido como verdadeiro se poucos precursores forem encontrados.A força iônica mínima do precursor foi definida como 5,0e3 e estados de carga do precursor até +8 foram incluídos nos experimentos.
O tempo de ciclo entre as principais varreduras no modo de correlação de dados foi definido para 2,5 segundos.A exclusão dinâmica de massa foi ajustada para 20 s após a primeira fragmentação do íon precursor.A janela de isolamento do precursor foi definida para 2 Th.O tipo de energia de colisão normalizada com um modo de energia de colisão fixa foi escolhido em uma varredura MS/MS dependente de dados.Energia de colisão definida para 30%.A resolução do Orbitrap foi definida em 15.000 e a meta do AGC em 100%.O tempo máximo de injeção personalizado é definido como 60 milissegundos.
Antes de rastrear a rede proteína-proteína em amostras reticuladas, processamos os arquivos brutos usando o pacote MaxQuant (versão 1.6.12.0) para identificar peptídeos/proteínas rastreáveis ​​nas amostras.Além disso, análises proteômicas semelhantes foram realizadas em amostras Flo-1 não reticuladas tratadas e não tratadas com IFNα.Os dados MS/MS foram pesquisados ​​no banco de dados humano UniProt (www.uniprot.org) (carregado em 12 de agosto de 2020, contém 75.093 entradas) usando o mecanismo de busca integrado Andromeda27.A busca foi realizada sem indicação da especificidade da enzima e diversas modificações de desamidação (N, Q) e oxidação (M).As tolerâncias de massa do precursor foram fixadas em 20 ppm e os íons produtos em 0,02 Da.O desvio de massa inicial e máximo foi definido em 10 ppm.A massa máxima do peptídeo foi fixada em 4600 Da e a similaridade de sequência foi definida entre 7 e 25 aminoácidos (aa).Outras análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa Perseus (versão 1.6.10.45).O conteúdo proteico foi calculado normalizando a intensidade espectral da proteína (intensidade LFQ; quantificação não marcada)27 e os valores de intensidade foram convertidos para Log2.Um agrupamento hierárquico de proteínas identificadas pela sua intensidade peptídica foi construído usando o pacote pheatmap (v1.0.12) em R (v 4.1.2).A análise de enriquecimento da via foi realizada utilizando o banco de dados da via Reactome para proteínas tratadas com IFNα que foram ativadas mais de quatro vezes em comparação com amostras não tratadas.
A identificação de reticulações químicas específicas de lisina (K) ou serina (S) de complexos proteicos monitorados por LC-MS/MS foi realizada utilizando uma máquina de identificação espectroscópica (SIM-XL) para peptídeos reticulados (SIM-XL) .Primeiro, possíveis interações entre genes de assinatura de resistência a danos no DNA (IRDS) associados a interferon (IFN) foram investigadas usando o conjunto de dados de proteínas IRDS descrito em Padariya et al.28.A triagem de todas as condições e repetições de todo o UniProt humano é computacionalmente intensiva, portanto, todo o banco de dados UniProt humano (www.uniprot.org) (baixado em 12 de agosto de 2020, contém 75.093 entradas) contra repetições tratadas com IFNα.Um dos filtros para interações de alta confiança.Essas interações de alta significância obtidas foram ampliadas e testadas em todas as repetições e condições.
No SIM-XL, o DSS foi usado para o reticulador (XL) e a mudança de peso XL e a mudança de peso de modificação foram definidas para 138,06 e 156,07, respectivamente.São considerados os seguintes sítios de reação de reticulação: KK, KS e KN-TERM, sem íons repórteres.Tanto o precursor quanto o fragmento ppm foram definidos para 20 e o limite de Xrea foi definido para 0,15.A tripsina foi considerada completamente específica e um método de fragmentação C-trap de alta energia (HCD) foi implementado.O limite de redução dinâmica de DB do XCorr e o número mínimo de peptídeos para redução dinâmica de DB foram definidos para 2,5 e 2, respectivamente.Outros parâmetros são: probabilidade de monoisótopos e corte de coincidência de pico, mínimo de 4 resíduos AA por fita e carga máxima de fita e 3 máximos de divisões perdidas.Os mapas 2D costurados resultantes foram analisados ​​em (SIM-XL) e a representação gráfica xQuest28 foi usada para construir os mapas 2D.As ligações cruzadas de proteínas em estruturas de proteínas são fornecidas em PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, versão 2.0 Schrödinger, LLC).
Estruturas de modelos de proteínas foram criadas usando o servidor Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 usando os princípios de modelagem de homologia e implementação do “Método Oculto de Markov”.Phyre2 gera estruturas modelo baseadas no alinhamento de sequências com estruturas proteicas conhecidas.Para as proteínas H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 e MDN1, foram utilizadas estruturas modelo 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 e 6i2665.Além disso, também foi considerada a estrutura do AlphaFold71 MX1, UBP18 e ROBO1.A estrutura da proteína foi visualizada usando o pacote BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, EUA) e o pacote Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canadá).