347 12.7*1.24mm Tubo enrolado de aço inoxidável, mecanismo molecular de condensação eletrostática síncrona e coagregação de α-sinucleína e tau

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Especificação de tubo de aço inoxidável 347

347 tubulação espiralada de aço inoxidável de 12,7*1,24mm

Diâmetro externo: 6,00 mm de diâmetro externo até 914,4 mm de diâmetro externo, tamanhos de até 24" NB disponíveis em estoque, tubos de aço de tamanho OD disponíveis em estoque

Faixa de espessura do tubo SS 347: 0,3 mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
Peso: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etc. (0,5-12 mm) Ou tamanho não regular a ser adaptado conforme necessário

Tipo: Tubos sem costura SS 347 |Tubos SS 347 ERW |Tubos soldados SS 347 |Tubos fabricados em SS 347 |Tubos SS 347 CDW, tubos LSAW / soldados por costura / redesenhados

Forma: Tubos/tubos redondos SS 347, tubos/tubos quadrados SS 347, tubos/tubos retangulares SS 347, tubos enrolados SS 347, formato “U” SS 347, bobinas de bolo Pan SS 347, tubos hidráulicos SS 347

Comprimento: Aleatório Único, Aleatório Duplo e Extremidade de comprimento necessário: Extremidade lisa, Extremidade chanfrada, Treaded

Proteção final: Tampas plásticas |Acabamento externo: 2B, No.4, No.1, No.8 Acabamento espelhado para tubos de aço inoxidável, acabamento conforme requisitos do cliente

Condição de entrega: recozido e decapado, polido, recozido brilhante, estirado a frio

Inspeção, Relatórios de Teste: Certificados de Teste de Moinho, EN 10204 3.1, Relatórios Químicos, Relatórios Mecânicos, Relatórios de Teste PMI, Relatórios de Inspeção Visual, Relatórios de Inspeção de Terceiros, Relatórios de Laboratório Aprovados pela NABL, Relatório de Teste Destrutivo, Relatórios de Teste Não Destrutivos

Embalagem: Embalado em caixas de madeira, sacos plásticos, tiras de aço agrupadas ou conforme solicitações dos clientes

Especiais: Tamanhos e especificações diferentes dos acima podem ser fabricados mediante solicitação

Faixa de tamanho do tubo SS 347: 1/2 polegada NB, OD a 24 polegadas

ASTM A312 347: Tubo austenítico soldado sem costura e com costura reta destinado a altas temperaturas e serviços corrosivos em geral.Metal de adição não permitido durante a soldagem.

ASTM A358 347: Tubo austenítico soldado por fusão elétrica para serviços corrosivos e/ou de alta temperatura.Normalmente, apenas tubos de até 8 polegadas são produzidos com esta especificação.A adição de metal de adição é permitida durante a soldagem.

ASTM A790 347: Tubo ferrítico/austenítico (duplex) soldado sem costura e com costura reta destinado a serviços corrosivos em geral, com ênfase particular na resistência à fissuração por corrosão sob tensão.

ASTM A409 347: Tubo de parede leve austenítico soldado por fusão elétrica com costura reta ou espiral, de grande diâmetro, nos tamanhos 14” a 30” com paredes Sch5S e Sch 10S para corrosão e/ou alta

ASTM A376 347: Tubo austenítico sem costura para aplicações em altas temperaturas.

ASTM A813 347: Tubo austenítico de costura única, solda simples ou dupla para aplicações corrosivas em geral e altas temperaturas.

ASTM A814 347: Tubo austenítico soldado trabalhado a frio para altas temperaturas e serviços corrosivos em geral.

Composição química dos tubos de aço inoxidável 347H

Propriedades mecânicas do tubo de aço inoxidável 347H

Propriedades físicas dos tubos de aço inoxidável 347H

Classes equivalentes para tubo de aço inoxidável 347H

A agregação de alfa-sinucleína amilóide (αS) é uma marca registrada da doença de Parkinson e de outras sinucleinopatias.Recentemente, a proteína tau comumente associada à doença de Alzheimer foi associada à patologia αS e descobriu-se que co-localiza-se em inclusões ricas em αS, embora o mecanismo molecular de coagregação das duas proteínas permaneça obscuro.Relatamos aqui que a fase αS se separa em condensados ​​líquidos através de condensação eletrostática complexa com polipeptídeos carregados positivamente, como o tau.Dependendo da afinidade do αS pelos policatiões e da taxa de depleção de valência da rede de coagulação, os coágulos sofrem uma rápida gelificação ou coalescência seguida por uma lenta agregação amilóide.Ao combinar um conjunto de técnicas biofísicas avançadas, fomos capazes de caracterizar a separação de fases αS/Tau líquido-líquido e identificar os principais fatores que levam à formação de agregados heterogêneos contendo ambas as proteínas em um condensado proteico líquido.
Além dos compartimentos de membrana, a separação espacial nas células também pode ser alcançada pela formação de corpos densos, ricos em proteínas e semelhantes a líquidos, chamados condensados ​​ou gotículas biomoleculares, através de um processo conhecido como separação de fases líquido-líquido (LLPS).Essas gotículas são formadas por interações temporais multivalentes, geralmente entre proteínas ou proteínas e RNA, e desempenham uma variedade de funções em quase todos os sistemas vivos.Um grande número de proteínas capazes de LLP exibem sequências de baixa complexidade que são altamente desordenadas na natureza e na formação de condensados ​​biomoleculares .Numerosos estudos experimentais revelaram a natureza flexível, muitas vezes desordenada e multivalente das proteínas que compõem estes condensados ​​do tipo líquido, embora pouco se saiba sobre os determinantes moleculares específicos que controlam o crescimento e a maturação destes condensados ​​para um aspecto mais sólido. estado..
Os novos dados apoiam a hipótese de que os LLPS aberrantes acionados por proteínas e a transformação de gotículas em estruturas sólidas podem ser vias celulares relevantes que levam à formação de agregados tóxicos insolúveis que são frequentemente características de doenças degenerativas.Muitas proteínas intrinsecamente desordenadas (IDPs) associadas a LLPS, muitas vezes altamente carregadas e flexíveis, têm sido associadas há muito tempo à neurodegeneração através do processo de agregação amilóide.Em particular, foi demonstrado que condensados ​​​​biomoleculares de IDP, como FUS7 ou TDP-438, ou proteínas com grandes domínios de baixa complexidade, como hnRNPA19, envelhecem em formas semelhantes a gel ou mesmo sólidas através de um processo chamado fluidização.composto.à transição de fase sólida (LSPT) em função do tempo ou em resposta a certas modificações pós-traducionais ou mutações patologicamente significativas1,7.
Outro IDP associado ao LLPS in vivo é a Tau, uma proteína desordenada associada aos microtúbulos cuja agregação amilóide tem sido implicada na doença de Alzheimer, mas também foi recentemente implicada na doença de Parkinson (DP) e outras proteinopatias nucleares sinápticas 11, 12, 13 estão relacionadas.Demonstrou-se que a tau se dissocia espontaneamente da solução / citoplasma devido a interações eletrostáticas favoráveis, resultando na formação de gotículas enriquecidas com tau conhecidas como coacervados eletrostáticos.Também foi observado que este tipo de interação inespecífica é a força motriz por trás de muitos condensados ​​biomoleculares na natureza .No caso de uma proteína tau, a agregação eletrostática pode ser formada por agregação simples, na qual regiões da proteína com carga oposta desencadeiam o processo de clivagem, ou por agregação complexa através da interação com polímeros carregados negativamente, como o RNA.
Recentemente, a α-sinucleína (αS), um IDP amilóide implicado na DP e outras doenças neurodegenerativas conhecidas coletivamente como sinucleinopatia17,18, foi demonstrada em modelos celulares e animais19,20 concentrados em condensados ​​proteicos com comportamento semelhante a fluido.Estudos in vitro demonstraram que αS sofre LLPS por agregação simples através de interações predominantemente hidrofóbicas, embora este processo exija concentrações proteicas excepcionalmente altas e tempos de incubação atipicamente longos .Se os condensados ​​contendo αS observados in vivo são formados por este ou outros processos LLPS permanece uma questão chave não resolvida.Da mesma forma, embora a agregação amilóide αS tenha sido observada em neurônios na DP e outras sinucleinopatias, o mecanismo exato pelo qual a αS sofre agregação amilóide intracelular permanece obscuro, uma vez que a superexpressão desta proteína não parece desencadear este processo por si só.Freqüentemente, são necessários danos celulares adicionais, sugerindo que certas localizações celulares ou microambientes são necessários para a renucleação de conjuntos amiloides αS intracelulares.Um ambiente celular que é particularmente propenso à agregação pode ser o interior dos condensados ​​proteicos 23 .
Curiosamente, descobriu-se que αS e tau co-localizam-se em inclusões características de doenças em humanos com doença de Parkinson e outras sinucleinopatias 24,25 e experimentos relataram uma relação patológica sinérgica entre as duas proteínas 26,27 sugerindo uma relação potencial entre agregação αS e tau em doenças neurodegenerativas.doença.Descobriu-se que αS e tau interagem e promovem a agregação um do outro in vitro e in vivo 28,29 e agregados heterogêneos compostos por essas duas proteínas foram observados no cérebro de pacientes com sinucleinopatias 30 .No entanto, pouco se sabe sobre a base molecular da interação entre αS e tau e o mecanismo de sua coagregação.Foi relatado que αS interage com tau através de uma atração eletrostática entre a região C-terminal altamente carregada negativamente de αS e a região central rica em prolina de tau, que também é enriquecida em resíduos carregados positivamente.
Neste estudo, mostramos que αS pode de fato dissociar-se em gotículas através de condensação eletrostática complexa na presença de proteína tau, em contraste com sua interação com outros polipeptídeos carregados positivamente, como a poli-L-lisina (pLK), e neste processo.αS atua como uma molécula de estrutura para a rede de gotículas.Identificamos diferenças perceptíveis no processo de maturação dos coacervados αS eletrostáticos, que estão associadas a diferenças na valência e força de interação das proteínas envolvidas na rede de coacervados.Curiosamente, observamos a coagregação de proteínas amilóides αS e tau em coacervados líquidos de longa vida e identificamos alguns fatores-chave que levam à coagregação dessas duas proteínas em tais coacervados.Aqui descrevemos detalhadamente esse processo, que é um possível mecanismo molecular subjacente à colocalização de duas proteínas em inclusões específicas de doenças.
αS tem uma cauda C-terminal altamente aniônica em pH neutro (Fig. 1a), e levantamos a hipótese de que ele poderia sofrer LLPS através da condensação de complexos eletrostáticos com moléculas polipeptídicas desordenadas policatiônicas.Usamos uma poli-L-lisina de 100 resíduos (pLK) como molécula modelo inicial devido à sua natureza polimérica desordenada e carregada positivamente em pH neutro 32. Primeiro, confirmamos que pLK interage com o domínio Ct de αS via espectroscopia de RMN de solução (Figura 1b) usando αS marcado com 13C/15N na presença de proporções molares crescentes de αS:pLK.A interação do pLK com o domínio Ct de αS se manifesta em perturbações do deslocamento químico e diminuição da intensidade do pico nesta região da proteína.Curiosamente, quando misturamos αS com pLK a uma concentração de αS de aprox.5–25 µM na presença de polietilenoglicol (5–15% PEG-8) (tampão LLPS típico: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) passamos imediatamente por um amplo campo de formação de proteínas .gotículas foram observadas usando microscopia de fluorescência (WF) e campo claro (BF) (Fig. 1c).Gotículas de 1-5 µm contendo αS concentrado (adicionado 1 µM de αS marcado com AlexaFluor488, AF488-αS), suas propriedades eletrostáticas podem ser derivadas de sua resistência a 10% de 1,6-hexanodiol (1,6-HD) e sua sensibilidade a um aumento na concentração de NaCl (Fig. 1c).A natureza fluida dos coacervados do complexo eletrostático αS / pLK é demonstrada pela sua capacidade de fundir em milissegundos (Fig. 1d).Utilizando turbidimetria, quantificamos a formação de gotículas nessas condições, confirmamos a natureza eletrostática da principal interação associada à sua estabilidade (Fig. 1e) e avaliamos o efeito de várias proporções de polímeros no processo LLPS (Fig. 1f).Embora a formação de gotículas seja observada em uma ampla faixa de proporções de polímeros, o processo é muito favorável quando o pLK excede αS.LLPs também foram observados usando o agente de deslocamento quimicamente diferente dextrano-70 (70 kDa) ou usando uma variedade de formatos de amostra, incluindo gotas de lâmina de vidro, poços de microplacas de vários materiais, Eppendorf ou capilares de quartzo.
uma representação esquemática de diferentes regiões proteicas nas variantes WT-αS e ΔCt-αS utilizadas neste estudo.O domínio N-terminal anfipático, a região hidrofóbica formadora de amilóide (NAC) e o domínio C-terminal carregado negativamente são mostrados em azul, laranja e vermelho, respectivamente.O mapa Net Charge Per Residual (NCPR) do WT-αS é mostrado.b Análise de RMN da interação αS/pLK na ausência de aglomerados macromoleculares.À medida que a concentração de pLK aumenta (as razões molares αS:pLK de 1:0,5, 1:1,5 e 1:10 são mostradas em verde claro, verde e verde escuro, respectivamente).c Coacervado αS/pLK (proporção molar 1:10) a 25 µM (1 µM de αS marcado com AF488 ou pLK marcado com Atto647N para imagem WF) em tampão LLPS (superior) ou suplementado com NaCl 500 mM (canto inferior esquerdo) ou após 10 % 1,6-hexanodiol (1,6-HD; canto inferior direito).Barra de escala = 20 μm.d Imagens microscópicas representativas da fusão de gotículas BF de αS/pLK (proporção molar 1:10) a uma concentração de 25 μM;as setas indicam a fusão de gotas individuais (setas vermelhas e amarelas) em uma nova gota (seta laranja) dentro de 200 ms).Barra de escala = 20 μm.e Dispersão de luz (a 350 nm) agregação αS/pLK em tampão LLPS antes e depois da adição de NaCl 500 mM ou 1,6-HD a 10% a 25 µM αS (N = 3 réplicas de amostra, média e desvio padrão também indicados).Imagem f BF (parte superior) e análise de dispersão de luz (a 350 nm, parte inferior) da agregação αS/pLK a 25 μM αS com aumento da razão molar αS:pLK (N = 3 réplicas de amostra, média e desvio padrão também indicados).Barra de escala = 10 μm.A barra de escala em uma imagem indica a escala de todas as imagens em um painel.Os dados brutos são fornecidos na forma de arquivos de dados brutos.
Com base em nossas observações da condensação do complexo eletrostático αS/pLK e observações anteriores de αS como uma molécula cliente do condensado tau/RNA através da interação direta com tau31, levantamos a hipótese de que αS e tau poderiam co-segregar com o solvente na ausência de RNA condensação.através de complexos eletrostáticos, e αS é a proteína de suporte em coacervados αS/Tau (ver distribuição de carga tau na Figura 2e).Observamos que quando 10 μM αS e 10 μM Tau441 (contendo 1 μM AF488-αS e 1 μM Atto647N-Tau, respectivamente) foram misturados em tampão LLPS, eles formaram facilmente agregados proteicos contendo ambas as proteínas, como visto pela microscopia WF.(Fig. 2a).A colocalização das duas proteínas nas gotículas foi confirmada por microscopia confocal (CF) (Figura 1a Complementar).Comportamento semelhante foi observado quando o dextrano-70 foi utilizado como agente de agregação (Figura 1c Complementar).Utilizando PEG ou dextrano marcado com FITC, descobrimos que ambos os agentes de aglomeração estavam distribuídos uniformemente pelas amostras, não mostrando segregação nem associação (Figura 1d suplementar).Pelo contrário, sugere que neste sistema promovem a separação de fases através de efeitos de aglomeração macromolecular, uma vez que o PEG é um agente de aglomeração preferencialmente estável, como visto em outros sistemas LLP .Estas gotículas ricas em proteínas foram sensíveis ao NaCl (1 M), mas não ao 1,6-HD (10% v / v), confirmando as suas propriedades electrostáticas (Figura 2a, b suplementar).Seu comportamento fluido foi confirmado pela observação de eventos de fusão de gotículas em milissegundos usando microscopia BF (Fig. 2b).
imagens de microscopia confocal (CF) de coacervados αS/Tau441 em tampão LLPS (10 μM de cada proteína, 0,5 μM de αS marcado com AF488 e Tau441 marcado com Atto647N).b Imagens representativas de contraste de interferência diferencial (DIC) de eventos de fusão de gotículas αS/Tau441 (10 μM para cada proteína).c Diagrama de fase baseado na dispersão de luz (a 350 nm) de Tau441 LLPS (0–15 µM) na ausência (esquerda) ou presença (direita) de 50 µM αS.Cores mais quentes indicam mais dispersão.d Dispersão de luz de amostras αS/Tau441 LLPS com concentração crescente de αS (Tau441 a 5 µM, N = 2–3 repetições de amostra conforme indicado).e Representação esquemática de algumas variantes da proteína tau e diferentes regiões da proteína usada neste estudo: domínio N-terminal carregado negativamente (vermelho), região rica em prolina (azul), domínio de ligação a microtúbulos (MTBD, destacado em laranja) e espiral de pares formadores de amiloide.regiões filamentares (PHF) localizadas dentro do MTBD (cinza).O mapa Net Charge Per Residue (NCPR) de Tau441 é mostrado.f Usando 1 µM de αS marcado com AF488 e ΔNt- marcado com Atto647N, usando 1 µM de αS ou ΔCt-αS marcado com AF488 na presença de ΔNt-Tau (parte superior, 10 µM por proteína) ou K18 (parte inferior, 50 µM por proteína ) ) ) micrografias de WF condensadas em buffer LLPS ou K18.As barras de escala em uma imagem representam a escala de todas as imagens em um painel (20 μm para os painéis a, b e f).Os dados brutos dos painéis c e d são fornecidos como arquivos de dados brutos.
Para testar o papel do αS neste processo LLPS, primeiro investigamos o efeito do αS na estabilidade das gotículas por nefelometria usando concentrações crescentes de NaCl (Fig. 2c).Quanto maior a concentração de sal nas amostras contendo αS, maiores serão os valores de dispersão de luz (a 350 nm), o que indica o papel estabilizador do αS neste sistema LLPS.Um efeito semelhante pode ser observado aumentando a concentração de αS (e, portanto, a razão αS:Tau441) para aprox.Aumento de 10 vezes em relação à concentração de tau (5 µM) (Fig. 2d).Para demonstrar que αS é uma proteína de suporte em coacervados, decidimos investigar o comportamento do mutante Tau interrompido por LLPS, que não possui uma região N-terminal carregada negativamente (resíduos 1–150, ver Fig. 2e) chamada ΔNt-Tau.A microscopia WF e a nefelometria confirmaram que o próprio ΔNt-Tau não sofreu LLPS (Fig. 2f e Fig. Complementar 2d), como relatado anteriormente 14. No entanto, quando αS foi adicionado a soluções de dispersão desta variante truncada de Tau, o processo LLPS foi completamente restaurado com densidade de gotículas próxima à densidade de gotículas de soluções em tamanho real de Tau e αS sob condições e concentrações de proteína semelhantes.Este processo também pode ser observado sob condições de baixo apinhamento macromolecular (Fig. Complementar 2c).O papel da região αS C-terminal, mas não de todo o seu comprimento, no processo LLPS foi demonstrado pela inibição da formação de gotículas usando uma variante αS truncada C-terminal sem os resíduos 104-140 (Fig. 1a) do (ΔCt- αS) proteína (Fig. 2f e Fig. Complementar 2d).A colocalização de αS e ΔNt-Tau foi confirmada por microscopia confocal de fluorescência (Figura 1b suplementar).
Para testar ainda mais o mecanismo LLPS entre Tau441 e αS, uma variante Tau adicional foi usada, ou seja, o fragmento de núcleo de filamento helicoidal pareado (PHF) no domínio de ligação a microtúbulos (MTBD), que contém quatro domínios de repetição característicos, comumente também conhecidos como o fragmento K18 (ver Fig. 2e).Foi recentemente relatado que αS se liga preferencialmente a uma proteína tau localizada num domínio rico em prolina numa sequência que precede o domínio de ligação aos microtúbulos.No entanto, a região PHF também é rica em resíduos carregados positivamente (ver Figura 2e), especialmente lisina (15% de resíduos), o que nos levou a testar se esta região também contribui para a condensação do complexo αS/Tau.Observamos que o K18 sozinho não poderia desencadear LLPS em concentrações de até 100 μM nas condições testadas (tampão LLPS com 15% de PEG ou 20% de dextrano) (Figura 2f).No entanto, quando adicionamos 50 µM de αS a 50 µM de K18, a rápida formação de gotículas de proteína contendo K18 e αS foi observada por nefelometria (Fig. Complementar 2d) e microscopia WF (Fig. 2f).Como esperado, ΔCt-αS não foi capaz de restaurar o comportamento LLPS do K18 (Fig. 2f).Observamos que a agregação αS/K18 requer concentrações de proteína ligeiramente mais altas para induzir LLPS em comparação com αS/ΔNt-Tau ou αS/Tau441, sendo outras coisas iguais.Isto é consistente com uma interação mais forte da região αS C-terminal com o domínio Tau rico em prolina em comparação com o domínio de ligação aos microtúbulos, como descrito anteriormente 31.
Dado que ΔNt-Tau não pode realizar LLPS na ausência de αS, escolhemos esta variante Tau como modelo para caracterizar αS/Tau LLPS dada a sua simplicidade em sistemas LLPS com Tau de comprimento total (isótipo, Tau441/Tau441).com processos de agregação complexos (heterotípicos, αS/Tau441).Comparamos o grau de agregação de αS (como parte da proteína de fase condensada, fαS,c) nos sistemas αS/Tau e αS/ΔNt-Tau por centrifugação e análise SDS-PAGE de fase dispersa (ver 2e), encontramos valores muito semelhantes ​​para todas as proteínas na mesma concentração.Em particular, obtivemos fαS,c 84 ± 2% e 79 ± 7% para αS/Tau e αS/ΔNt-Tau, respectivamente, sugerindo que a interação heterotípica entre αS e tau é superior à interação entre moléculas de tau.entre.
A interação com vários policátions e o efeito do processo de condensação na cinética do αS foram estudados pela primeira vez pelo método de recuperação de fluorescência após fotodegradação (FRAP).Testamos coacervados αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau e αS / pLK (100 μM αS suplementado com 2 μM αS AF488-αS e 100 μM Tau441 ou ΔNt-Tau ou 1 mM pLK).Os dados foram obtidos nos primeiros 30 minutos após a mistura dos componentes da amostra.A partir de imagens representativas de FRAP (Fig. 3a, condensação αS / Tau441) e suas correspondentes curvas de curso de tempo (Fig. 3b, Figura 3 suplementar), pode-se observar que a cinética de αS é muito semelhante àquelas dos coacervados Tau441.e ΔNt-Tau, que é muito mais rápido com pLK.Os coeficientes de difusão calculados para αS dentro do coacervado de acordo com FRAP (conforme descrito por Kang et al. 35) são D = 0,013 ± 0,009 µm2/s e D = 0,026 ± 0,008 µm2/s para αS/Tau441 e αS/ΔNt- para o sistema αS/.pLK, Tau e D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, respectivamente (Fig. 3c).No entanto, o coeficiente de difusão αS na fase dispersa é várias ordens de grandeza superior a todas as fases condensadas, conforme determinado pela Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS, ver Figura 3 suplementar) sob as mesmas condições (tampão LLPS), mas na ausência de policátions ( D = 8 ± 4 µm2/s).Portanto, a cinética da tradução de αS é significativamente reduzida em coacervados em comparação com proteínas na fase dispersa devido a pronunciados efeitos de aglomeração molecular, embora todos os coacervados retenham propriedades líquidas durante a primeira meia hora após a sua formação, em contraste com a fase tau.cinética mais rápida no condensado pLK.
Análise a – c FRAP da dinâmica de αS (2% de αS marcado com AF488) em coacervados eletrostáticos.Imagens representativas dos ensaios αS/Tau441 FRAP em triplicado são mostradas em (a), onde círculos vermelhos indicam áreas descoloridas.A barra de escala é 5 µm.b Curvas FRAP médias e (c) coeficientes de difusão calculados (D) para 5–6 (N) gotículas diferentes de três experimentos usando 100 µM αS e concentrações equimolares de Tau441 (vermelho) ou ΔNt-Tau (azul) ou pLK (verde) em dez vezes a concentração de LLPS.O desvio padrão da curva FRAP é mostrado em cor sombreada.Para comparação, o coeficiente de difusão αS na fase dispersa foi determinado em triplicata usando espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) (ver Figura Suplementar 3 e métodos para mais informações).d Espectros EPR contínuos de banda X de 100 μM TEMPOL-122-αS em tampão LLPS sem qualquer policatião (preto) ou na presença de 100 μM Tau441 (vermelho) ou ΔNt-Tau (azul) ou 1 mM pLK (verde).A inserção mostra uma visão ampliada das fortes linhas de campo onde ocorrem as mudanças mais dramáticas.e Curvas de ligação de 50 μM TEMPOL-122-αS com vários policátions na ausência de LLPS (sem PEG).A amplitude reduzida da banda III em comparação com a banda II (IIII/III) do espectro EPR normalizado aumenta as proporções molares de Tau441 (vermelho), ΔNt-Tau (azul) e pLK (verde).As linhas coloridas mostram o ajuste aos dados usando um modelo de ligação aproximado com n locais de ligação idênticos e independentes em cada curva.Os dados brutos são fornecidos na forma de arquivos de dados brutos.
Como complemento, investigamos a dinâmica de αS em vários coacervados utilizando marcação de spin dirigida (SDSL) e ressonância paramagnética eletrônica contínua (CW-EPR).Este método provou ser muito útil no relato da flexibilidade e dinâmica do PDI com uma resolução residual realista36,37,38.Para tanto, construímos resíduos de cisteína em mutantes Cys únicos e utilizamos a sonda de spin 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-oxil (TEMPOL).Os derivados da maleimida os rotulam.Mais especificamente, inserimos sondas TEMPOL na posição 122 ou 24 αS (TEMPOL-122-αS e TEMPOL-24-αS).No primeiro caso, temos como alvo a região C-terminal da proteína, que está envolvida na interação com policátions.Em vez disso, a posição 24 pode nos dar informações sobre a dinâmica geral das proteínas no condensado.Em ambos os casos, os sinais EPR obtidos para proteínas da fase dispersa corresponderam a radicais nitróxidos no estado de movimento rápido.Após a separação de fases na presença de tau ou pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ou ΔNt-Tau na proporção de 1:1 ou pLK na proporção de 1:10), foi observado um aumento na intensidade relativa do pico em o espectro EPR de αS.A linha de perda se ampliou, indicando redução da cinética de reorientação de αS nas gotículas em comparação com a proteína na fase diluída (Fig. 3d, Fig. Complementar 4a).Estas alterações são mais pronunciadas na posição 122. Enquanto na posição 24 a presença de pLK não afetou a cinética da sonda, na posição 122 o formato da linha espectral mudou significativamente (Fig. Complementar 4a).Quando tentamos modelar os espectros na posição 122 de dois sistemas αS/policátion usando o modelo isotrópico (Figura 5a suplementar) comumente usado para descrever a dinâmica do IDP marcado com spin38,39, não conseguimos reconstruir os espectros experimentais..Simulação espectral da posição de contrastes de 24 spins (Fig. Complementar 5a).Isto sugere que existem posições preferenciais no espaço de configurações de spin da região C-terminal de αS na presença de policátions.Ao considerar a fração de αS na fase condensada sob condições experimentais de EPR (84 ± 2%, 79 ± 7% e 47 ± 4% para αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau e αS/pLK, respectivamente - consulte Suplemento Fig. 2e da ​​análise de dados c), pode-se observar que o alargamento detectado pelo método EPR reflete principalmente a interação da região C-terminal de αS com vários policátions na fase condensada (a principal mudança ao usar TEMPOL-122- αS), e não condensação de proteínas.Um aumento na microviscosidade é observado na sonda.Como esperado, o espectro EPR da proteína sob condições diferentes do LLPS foi completamente restaurado quando NaCl 1 M foi adicionado à mistura (Fig. Complementar 4b).No geral, nossos dados sugerem que as alterações detectadas pelo CW-EPR refletem principalmente a interação da região C-terminal de αS com vários policatiões na fase condensada, e esta interação parece ser mais forte com pLK do que com Tau.
Para obter mais informações estruturais sobre as proteínas do coacervado, decidimos estudar o sistema LLPS utilizando RMN em solução.No entanto, só conseguimos detectar a fração αS remanescente na fase dispersa, o que pode ser devido à redução da dinâmica proteica dentro do coacervado e a uma fase densa no fundo da solução na análise de RMN.Quando analisamos a estrutura e dinâmica da proteína remanescente na fase dispersa da amostra LLPS usando RMN (Fig. Complementar 5c, d), notamos que a proteína se comportou quase de forma idêntica na presença de pLK e ΔNt-Tau, ambos de que estavam na estrutura secundária e na dinâmica da espinha dorsal da proteína, reveladas por experimentos sobre deslocamento químico secundário e relaxamento R1ρ.Os dados de RMN mostram que o terminal C de αS sofre uma perda significativa de flexibilidade conformacional, mantendo a sua natureza desordenada, como o resto da sequência proteica, devido às suas interacções com policatiões.
Como o alargamento do sinal CW-EPR observado na fase condensada TEMPOL-122-αS reflete a interação da proteína com policátions, realizamos uma titulação de EPR para avaliar a afinidade de ligação de αS a vários policátions na ausência de LLPS (sem acúmulo de Tampão LLPS), sugerindo que as interações são as mesmas nas fases diluída e concentrada (o que é confirmado pelos nossos dados, Figura 4a Complementar e Figura 6 Complementar).O objetivo era verificar se todos os coacervados, apesar de suas propriedades comuns semelhantes a fluidos, exibiam algum comportamento diferencial subjacente em nível molecular.Como esperado, o espectro EPR ampliou-se com o aumento da concentração de policatiões, refletindo uma diminuição na flexibilidade molecular devido às interações moleculares de todos os parceiros de interação quase até a saturação (Fig. 3e, Figura 6 suplementar).pLK alcançou esta saturação em uma razão molar mais baixa (policátion:αS) em comparação com ΔNt-Tau e Tau441.De fato, a comparação dos dados com um modelo de ligação aproximado assumindo n locais de ligação idênticos e independentes mostrou que a constante de dissociação aparente de pLK (~5 μM) é uma ordem de grandeza menor que a de Tau441 ou ΔNt-Tau (~50 μM ).µM).Embora esta seja uma estimativa aproximada, isto sugere que αS tem uma maior afinidade por policátions mais simples com regiões de carga positiva contínua.Dada esta diferença de afinidade entre αS e vários policatiões, levantamos a hipótese de que as suas propriedades líquidas podem mudar de forma diferente ao longo do tempo e, portanto, sofrer diferentes processos de LSPT.
Dado o ambiente altamente lotado dentro do coacervado proteico e a natureza amilóide da proteína, observamos o comportamento do coacervado ao longo do tempo para detectar possíveis processos de LSPT.Usando microscopia BF e CF (Figura 4), observamos que αS/Tau441 coacerva em grande extensão em solução, formando grandes gotículas que entram em contato e molham a superfície no fundo do poço/lâmina como gotículas completas, como esperado (Fig. Complementar .7d);chamamos essas estruturas formadas no fundo de “jangadas de proteína”.Essas estruturas permaneceram fluidas, pois retiveram a capacidade de fusão (Fig. Complementar 7b) e puderam ser vistas por várias horas após o LLPS ter sido acionado (Fig. 4 e Fig. Complementar 7c).Observamos que o processo de umedecimento é favorecido na superfície de materiais hidrofílicos em vez de hidrofóbicos (Fig. Complementar 7a), como esperado para coacervados eletrostáticos com cargas desequilibradas e, portanto, altos potenciais eletrostáticos de superfície.Notavelmente, a coalescência αS / ΔNt-Tau e o rafting foram significativamente reduzidos, enquanto os condensados ​​αS / pLK foram significativamente reduzidos (Fig. 4).Durante o curto tempo de incubação, as gotículas de αS/pLK foram capazes de coalescer e molhar a superfície hidrofílica, mas este processo parou rapidamente e após 5 horas de incubação, apenas foram observados eventos de coalescência limitados e nenhum molhamento.– transição gel-gotejamento.
BF representativo (painéis em escala de cinza) e CF (painéis da direita, αS marcado com AF488 em verde) de amostras de coacervado contendo 100 µM de αS (rótulo fluorescente a 1%) em tampão LLPS na presença de 100 µM Tau441 (topo) de fluorescência) imagens microscópicas ΔNt -Tau (centro) ou 1 mM pLK (parte inferior) em diferentes tempos de incubação e alturas focais (z, distância do fundo da placa).As experiências foram repetidas 4-6 vezes independentemente umas das outras com os mesmos resultados.Os coacervados αS/Tau441 são umedecidos após 24 horas, formando jangadas maiores que a imagem.A barra de escala para todas as imagens é de 20 µm.
Perguntamos então se os grandes pools de proteínas semelhantes a fluidos formados em αS/Tau441 LLPS levariam à agregação amilóide de qualquer uma das proteínas estudadas.Seguimos a maturação das gotículas de αS / Tau441 ao longo do tempo com microscopia WF sob as mesmas condições acima, mas usando 1 μM de αS marcado com AF488 e Tau441 marcado com Atto647N (Fig. 5a).Como esperado, observamos a localização completa da proteína ao longo do processo de maturação.Curiosamente, de ca.Após 5 horas, foram observadas estruturas não circulares mais intensas no interior das jangadas, que chamamos de “pontos”, alguns dos quais foram colocalizados com αS, e alguns foram enriquecidos em Tau441 (Fig. 5a, setas brancas).Essas manchas sempre foram observadas em jangadas em maior extensão para αS/ΔNt-Tau do que para αS/ΔNt-Tau.Não houve pontos distintos nas gotículas dos sistemas pLK e Tau incompetentes para fusão/umedecimento.Para testar se essas manchas contendo αS e Tau441 são agregados do tipo amilóide, realizamos um experimento semelhante usando microscopia CF na qual Tau441 foi marcado com Atto647N e 12,5 μM de tioflavina-T específica para amilóide (ThT) foi adicionada desde o início.tingir.Embora a coloração ThT de gotículas ou jangadas αS / Tau441 não tenha sido observada mesmo após 24 h de incubação (Fig. 5b, linha superior - gotículas restantes sobre jangadas de proteína), estruturas positivas para ThT contendo Atto647N-Tau441 dentro das jangadas eram muito fracas.isto replica o tamanho, a forma e a localização das manchas descritas anteriormente (Fig. 5b, linhas intermediárias e inferiores), sugerindo que as manchas podem corresponder a agregados semelhantes a amilóides formados em coacervados fluidos envelhecidos.
WF 25 μM αS em vários tempos de incubação e alturas focais (z, distância do fundo não ligado) na presença de 25 μM Tau441 (1 μM αS marcado com AF488 e Tau441 marcado com Atto647N) em um poço de uma placa de microscópio com tampão LLPS) .Seis experimentos foram repetidos independentemente com resultados semelhantes.b Imagem microscópica CF de 25 μM αS na presença de 25 μM Tau441 (1 μM Tau447 marcado com Atto647N) e 12,5 μM de tioflavina-T (ThT).Gotículas de proteína ponderadas e jangadas e manchas de proteína depositadas são mostradas nas linhas superior e intermediária, respectivamente.A linha inferior mostra imagens de jangadas e quedas de 3 réplicas independentes.As setas brancas indicam pontos positivos para ThT em ambos os painéis.A barra de escala para todas as imagens é de 20 µm.
Para examinar mais detalhadamente as mudanças na rede de proteínas coacervadas durante a transição do líquido para o sólido, utilizamos imagens de fluorescência vitalícia (FLIM) e microscopia de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) (Figura 6 e Figuras Suplementares 8 e 9).Nossa hipótese é que a maturação coacervada da camada em uma estrutura proteica agregada mais condensada ou mesmo sólida leva a um contato mais próximo entre a proteína e a sonda fluorescente ligada a ela, potencialmente produzindo um efeito de extinção manifestado em uma vida útil da sonda encurtada (τ) , conforme descrito anteriormente40.,41 ,42.Além disso, para amostras duplamente marcadas (AF488 e Atto647N como corantes doadores e aceitadores de FRET, respectivamente), esta diminuição em τ também pode ser acompanhada por condensação de coacervado e um aumento na eficiência de FRET (E) durante o LSPT.Monitoramos a formação de jangadas e manchas ao longo do tempo em amostras LLPS αS/Tau441 e αS/ΔNt-Tau (25 µM de cada proteína em tampão LLPS contendo 1 µM AF488 marcado com αS e/ou Atto647N marcado com Tau441 ou ΔNt-Tau).Observamos uma tendência geral em que o tempo de vida da fluorescência das sondas AF488 (τ488) e Atto647N (τ647N) diminuiu ligeiramente à medida que os coacervados amadureceram (Fig. 6 e Fig. Complementar 8c).Curiosamente, esta mudança foi significativamente aumentada para pontos dentro de jangadas (Fig. 6c), indicando que ocorreu mais condensação de proteínas em pontos.Em apoio a isso, nenhuma mudança significativa no tempo de vida da fluorescência foi observada para gotículas de αS / ΔNt-Tau envelhecidas por 24 h (Fig. Complementar 8d), sugerindo que a gelificação de gotículas é um processo distinto da mancha e que não é acompanhado por reorganização molecular significativa dentro de coacervados.Deve-se notar que os pontos possuem tamanhos diferentes e conteúdo variável em αS, especialmente para o sistema αS/Tau441 (Fig. Complementar 8e).A diminuição na vida útil da fluorescência spot foi acompanhada por um aumento na intensidade, especialmente para Tau441 marcado com Atto647N (Fig. Complementar 8a), e eficiências FRET mais altas para ambos os sistemas αS/Tau441 e αS/ΔNt-Tau, indicando condensação adicional em LLPS Cinco horas após o acionamento, as proteínas dentro da eletricidade estática se condensaram.Em comparação com αS/ΔNt-Tau, observamos valores mais baixos de τ647N e um pouco mais altos de τ488 em pontos αS/Tau441, acompanhados por valores de FRET mais baixos e mais heterogêneos.Possivelmente, isso pode estar relacionado ao fato de que no sistema αS/Tau441, a abundância de αS observada e esperada nos agregados é mais heterogênea, muitas vezes subestequiométrica em comparação com Tau, uma vez que o próprio Tau441 também pode sofrer LLPS e agregação (Fig. Complementar 8e) .No entanto, o grau de coalescência de gotículas, formação de jangadas e, mais importante, agregação de proteínas em coacervados semelhantes a líquidos é máximo quando Tau441 e αS estão presentes.
uma imagem de microscopia de fluorescência vitalícia (FLIM) de αS/Tau441 e αS/ΔNt-Tau a 25 μM de cada proteína (1 μM de αS marcada com AF488 e 1 μM de Tau441 ou ΔNt-Tau marcada com Atto647N) em tampão LLPS.As colunas mostram imagens representativas de amostras LLPS em diferentes tempos de maturação (30 min, 5 h e 24 h).O quadro vermelho mostra a região contendo manchas αS/Tau441.A expectativa de vida é mostrada como barras coloridas.Barra de escala = 20 μm para todas as imagens.b Imagem FLIM ampliada da área selecionada, mostrada na caixa vermelha no painel a.As faixas de vida são mostradas usando a mesma escala de cores do painel a.Barra de escala = 5 μm.c Histogramas mostrando AF488 (ligado a αS) ou Atto647N (ligado a Tau) para diferentes espécies de proteínas (gotículas-D-, raft-R- e speckle-P) identificadas em imagens FLIM registradas para αS-) distribuições de tempo de vida de Tau441 e Amostras de coacervado αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI para D, 29-44 ROI para R e 21-51 ROI para pontos).Os valores médios e medianos são mostrados como quadrados amarelos e linhas pretas dentro de caixas, respectivamente.Os limites inferior e superior da caixa representam o primeiro e terceiro quartis, respectivamente, e os valores mínimo e máximo dentro do intervalo interquartil (IQR) de 1,5 vezes são mostrados como bigodes.Os valores discrepantes são mostrados como losangos pretos.A significância estatística entre pares de distribuições foi determinada usando um teste t para duas amostras, assumindo variâncias desiguais.Os valores p do teste t bicaudal são mostrados com asteriscos para cada par de dados comparados (* valor p > 0,01, ** valor p > 0,001, *** valor p > 0,0001, **** valor p > 0,00001), ns Indica negligenciabilidade (valor p > 0,05).Os valores exatos de p são fornecidos na Tabela Suplementar 1, e os dados originais são apresentados como arquivos de dados brutos.
Para demonstrar ainda mais a natureza semelhante a amilóide de manchas/agregados, tratamos amostras de coacervado não coradas durante 24 horas com altas concentrações de NaCl (1 M), o que resultou na separação de agregados de coacervados proteicos.Quando agregados isolados (isto é, uma solução dispersa de agregados) foram observados usando microscopia de força atômica (AFM), observamos uma morfologia predominantemente esférica com altura regular de cerca de 15 nm, que tende a se associar sob condições de alta concentração de sal, semelhante a o comportamento das fibrilas amilóides típicas devido ao forte efeito hidrofóbico na superfície (observe que as fibrilas normalmente têm uma altura de ~ 10 nm) (Fig. Complementar 10a).Curiosamente, quando agregados isolados foram incubados com ThT em um ensaio de fluorescência ThT padrão, observamos um aumento dramático no rendimento quântico de fluorescência ThT, comparável ao observado quando o corante foi incubado com fibrilas amilóides αS típicas (Fig. Complementar 10b), sugerindo que os agregados coacervados contêm estruturas semelhantes a amilóides..De fato, os agregados eram tolerantes a altas concentrações de sal, mas sensíveis ao cloreto de guanidina 4 M (GdnHCl), como fibrilas amilóides típicas (Figura 10c Complementar).
Em seguida, analisamos a composição dos agregados usando fluorescência de molécula única, espectroscopia específica de correlação de fluorescência/correlação cruzada (FCS/FCCS) e análise de explosão de detecção de coincidência de duas cores (TCCD).Para este fim, isolamos agregados formados após 24 horas de incubação em 100 μl de amostras de LLPS contendo αS e Tau441 (ambos 25 μM) juntamente com 1 μM de αS marcado com AF488 e 1 μM de Tau441 marcado com Atto647N.Diluir a solução agregada dispersa resultante para um estado monomolecular usando o mesmo tampão livre de PEG e 1 M NaCl (o mesmo tampão usado para separar agregados de coacervado) para evitar possíveis interações eletrostáticas entre LLPS e proteína.Um exemplo da trajetória temporal de uma única molécula pode ser visto na Fig.A análise FCCS/FCS (correlação cruzada, CC e autocorrelação, AC) mostrou que agregados contendo αS e tau eram abundantes nas amostras (ver curva CC na Fig. 7b, painel esquerdo), e um excesso de proteína monomérica residual surgiu como um resultado do processo de diluição (ver curvas AC na Figura 7b, painel esquerdo).Experimentos de controle realizados sob as mesmas condições de solução usando amostras contendo apenas proteínas monoméricas não mostraram curvas CC, e as curvas AC se ajustaram bem ao modelo de difusão de um componente (Eq. 4), onde as proteínas monoméricas têm os coeficientes de difusão esperados (Fig. 7b). ), painel direito).O coeficiente de difusão das partículas agregadas é inferior a 1 µm2/s, e o das proteínas monoméricas é de cerca de 1 µm2/s.50–100 µm/s;os valores são semelhantes aos valores publicados anteriormente para fibrilas amilóides αS sonicadas e αS monomérico separadamente sob condições de solução semelhantes44.Quando analisamos os agregados com análise de explosão TCCD (Fig. 7c, painel superior), descobrimos que em cada agregado isolado (heteroagregado αS/Tau), cerca de 60% dos agregados detectados continham αS e tau, cerca de 30% continham apenas tau, cerca de 10% apenas de αS.A análise estequiométrica dos heteroagregados αS/Tau mostrou que a maioria dos heteroagregados foram enriquecidos em tau (estequiometria abaixo de 0,5, o número médio de moléculas de tau por agregado é 4 vezes maior que as moléculas de αS), o que é consistente com o nosso trabalho observado no FLIM in situ experimentos..A análise de FRET mostrou que esses agregados continham ambas as proteínas, embora os valores reais de FRET neste caso não sejam de grande importância, uma vez que a distribuição dos fluoróforos em cada agregado foi aleatória devido ao excesso de proteína não marcada utilizada no experimento.Curiosamente, quando realizamos a mesma análise usando a variante Tau deficiente em agregação amilóide madura 45,46 (ver Figura 11a, b suplementar), notamos que embora a agregação eletrostática αS fosse a mesma (Figura 11c, d suplementar), a capacidade de formar agregados dentro do coacervado foi drasticamente reduzida e o FLIM detectou vários pontos em experimentos in situ, e curvas de correlação cruzada fracas foram observadas para amostras agregadas isoladas.No entanto, para um pequeno número de agregados detectados (apenas um décimo de Tau441), observamos que cada agregado era enriquecido em αS do que esta variante Tau, com aproximadamente 50% dos agregados detectados contendo apenas moléculas de αS, e αS era heterogêneo em excesso .agregados (ver Figura 11e Complementar), em contraste com os agregados heterogêneos gerados por Tau441 (Fig. 6f).Os resultados destas experiências mostraram que embora o próprio αS seja capaz de se acumular com tau dentro do coacervado, a nucleação da tau é mais favorável nestas condições, e os agregados semelhantes a amilóides resultantes são capazes de actuar como uma forma de αS e tau.No entanto, uma vez formado um núcleo rico em tau, as interações heterotípicas entre αS e tau são favorecidas em agregados em detrimento das interações homotípicas entre moléculas de tau;também observamos redes de proteínas em coacervados αS/tau líquidos.
a Traços temporais de fluorescência representativos de moléculas únicas de agregados isolados formados em coacervados eletrostáticos αS/Tau441.Bursts correspondentes a coagregados αS/Tau441 (bursts acima do limite indicado) foram observados em três canais de detecção (emissão AF488 e Atto647N após excitação direta, linhas azuis e vermelhas, emissão Atto647N após excitação indireta), FRET, linha violeta).b Análise FCS/FCCS de uma amostra de agregados αS/Tau441 isolados obtidos de LLPS (painel esquerdo).As curvas de autocorrelação (AC) para AF488 e Atto647N são mostradas em azul e vermelho, respectivamente, e as curvas de correlação cruzada (CC) associadas a agregados contendo ambos os corantes são mostradas em roxo.As curvas AC refletem a presença de espécies proteicas monoméricas e agregadas marcadas, enquanto as curvas CC mostram apenas a difusão de agregados duplamente marcados.A mesma análise, mas sob as mesmas condições de solução que em pontos isolados, amostras contendo apenas αS monomérico e Tau441 são mostradas como controles no painel direito.c Análise de flash de fluorescência de moléculas únicas de agregados isolados formados em coacervados eletrostáticos αS/Tau441.As informações para cada agregado encontrado em quatro repetições diferentes (N = 152) são plotadas em relação à sua estequiometria, valores S e eficiência de FRET (painel superior, barra colorida reflete a ocorrência).Três tipos de agregados podem ser distinguidos: - agregados somente αS com S ~ 1 e FRET ~ 0, agregados somente Tau com S ~ 0 e FRET ~ 1 e agregados heterogêneos de Tau / αS com estimativas intermediárias de S e FRET da quantidade de ambas as proteínas marcadoras detectadas em cada agregado heterogêneo (N = 100) são mostradas no painel inferior (a escala de cores reflete a ocorrência).Os dados brutos são fornecidos na forma de arquivos de dados brutos.
Foi relatado que a maturação ou envelhecimento de condensados ​​proteicos líquidos em estruturas semelhantes a gel ou sólidas ao longo do tempo está envolvido em diversas funções fisiológicas do condensado47, bem como em doenças, como um processo anormal que precede a agregação amilóide 7, 48, 49. Aqui estudamos a separação de fases e o comportamento em detalhes.LSPT αS na presença de policátions aleatórios em um ambiente controlado em baixas concentrações micromolares e condições fisiologicamente relevantes (observe que a concentração fisiológica calculada de αS é> 1 µM50), seguindo o comportamento termodinamicamente típico do LPS.Descobrimos que αS, que contém uma região C-terminal altamente carregada negativamente em pH fisiológico, é capaz de formar gotículas ricas em proteínas em solução aquosa via LLPS na presença de peptídeos desordenados altamente catiônicos, como pLK ou Tau, através do processo de eletrostática. condensação complexa na presença de macromoléculas de agregação.Este processo pode ter efeitos relevantes no ambiente celular onde αS encontra várias moléculas policatiônicas associadas à sua agregação associada à doença, tanto in vitro quanto in vivo51,52,53,54.
Em muitos estudos, a dinâmica das proteínas dentro das gotículas tem sido considerada um dos principais fatores que determinam o processo de maturação55,56.Em coacervados αS eletrostáticos com policátions, o processo de maturação aparentemente depende da força das interações com os policátions, da valência e da multiplicidade dessas interações.A teoria do equilíbrio sugere que uma paisagem de equilíbrio de dois estados líquidos seria a presença de uma grande gota rica em biopolímeros que impulsionam o LLPS57,58.O crescimento das gotículas pode ser alcançado pela maturação de Ostwald59, coalescência60 ou consumo de monômero livre na fase dispersa61.Para αS e Tau441, ΔNt-Tau ou pLK, a maior parte da proteína foi concentrada no condensado nas condições utilizadas neste estudo.No entanto, enquanto as gotículas de tau em tamanho real coalesceram rapidamente após a umectação da superfície, a coalescência e a umectação das gotículas foram difíceis para ΔNt-Tau e pLK, sugerindo uma rápida perda de propriedades líquidas nestes dois sistemas.De acordo com a nossa análise FLIM-FRET, as gotículas envelhecidas de pLK e ΔNt-Tau mostraram um grau semelhante de agregação proteica (tempo de vida de fluorescência semelhante) às gotículas originais, sugerindo que a rede proteica original foi retida, embora mais rígida.
Racionalizamos nossos resultados experimentais no modelo a seguir (Figura 8).As gotículas inicialmente formadas temporariamente são frequentemente redes de proteínas sem compensação eletrostática e, portanto, existem áreas de desequilíbrio de carga, especialmente na interface das gotículas, resultando em gotículas com alto potencial eletrostático de superfície.Para compensar a carga (um fenômeno comumente referido como esgotamento de valência) e minimizar o potencial de superfície das gotículas, as gotículas podem incluir novos polipeptídeos da fase diluída, reorganizar redes de proteínas para otimizar as interações carga-carga e interagir com outras gotículas.com superfícies (umedecimento).As gotículas αS/pLK, devido à sua rede proteica mais simples (apenas interações heterotípicas entre αS e pLK) e maior afinidade pelas interações proteína-proteína, parecem ser capazes de equilibrar a carga do condensado mais rapidamente;de fato, observamos uma cinética proteica mais rápida em coacervados αS/pLK inicialmente formados do que em αS/Tau.Após o esgotamento da valência, as interações tornam-se menos efêmeras e as gotículas perdem suas propriedades líquidas e se transformam em gotículas não inflamáveis, semelhantes a gel, com baixo potencial eletrostático de superfície (e, portanto, incapazes de molhar a superfície).Em contraste, as gotículas αS/Tau são menos eficientes na otimização do equilíbrio de carga das gotículas devido a redes proteicas mais complexas (com interações homotípicas e heterotípicas) e à natureza mais fraca das interações proteicas.Isto resulta em gotículas que retêm o comportamento líquido por longos períodos de tempo e exibem um alto potencial eletrostático de superfície que tende a ser minimizado pela coalescência e crescimento (minimizando assim a relação área/volume de superfície das gotículas) e pelo umedecimento da superfície hidrofílica química.Isso cria grandes bibliotecas concentradas de proteínas que retêm propriedades fluidas, pois as interações permanecem muito transitórias devido à busca constante por otimização de carga na rede proteica.Curiosamente, as formas truncadas N-terminalmente de Tau, incluindo algumas isoformas de ocorrência natural, exibem comportamento intermediário, com alguns coacervados envelhecendo com αS em gotículas semelhantes a gel de longa vida, enquanto outros se transformam em grandes condensados ​​líquidos.Esta dualidade na maturação de coacervados eletrostáticos αS é consistente com estudos teóricos e experimentais recentes do LLPS que identificaram uma correlação entre o esgotamento de valência e a peneiração eletrostática em condensados ​​como uma chave para controlar o tamanho do condensado e as propriedades do fluido.Mecanismo 58.61.
Este esquema mostra a suposta via de agregação amilóide para αS e Tau441 via LLPS e LSPT.Com regiões adicionais ricas em ânions (vermelho) e ricas em cátions (azul), os coacervados eletrostáticos αS e tau com valência satisfatória têm menor energia superficial e, portanto, menos coalescência, resultando em rápido envelhecimento das gotas.É alcançado um estado de gel não aglomerado estável..Esta situação é muito favorável no caso do sistema αS/pLK devido à sua maior afinidade e rede de interação de pares de proteínas mais simples, o que permite uma rápida transição tipo gel.Pelo contrário, gotículas com valência insatisfatória e, portanto, regiões carregadas de proteínas disponíveis para interação, facilitam a fusão do coacervado e umedecimento da superfície hidrofílica, a fim de reduzir sua alta energia superficial.Esta situação é preferível para coacervados αS/Tau441, que possuem uma rede complexa multivalente que consiste em interações fracas Tau-Tau e αS-Tau.Por sua vez, coacervados maiores reterão mais prontamente as suas propriedades semelhantes a fluidos, permitindo que ocorram outras interações proteína-proteína.Eventualmente, agregados heterogêneos amilóides contendo αS e tau se formam dentro do fluido coacervado, o que pode estar relacionado àqueles encontrados em corpos de inclusão, que são características de doenças neurodegenerativas.
As grandes estruturas semelhantes a fluidos formadas durante a maturação de αS/Tau441 com um ambiente proteico altamente congestionado, mas dinâmico e, em menor grau, coacervados αS/ΔNt-Tau são reservatórios ideais para a nucleação da agregação de proteínas.De facto, observámos a formação de agregados proteicos sólidos neste tipo de coacervados proteicos, frequentemente contendo αS e tau.Mostrámos que estes heteroagregados são estabilizados por interacções não electrostáticas, são capazes de se ligar a corantes ThT específicos para amilóide da mesma forma que as fibrilas amilóides típicas e, de facto, têm resistência semelhante a várias influências.Demonstrou-se que os agregados αS/tau formados por LLPS possuem propriedades semelhantes às do amilóide.De facto, a variante madura de Tau deficiente em agregação amilóide é significativamente prejudicada na formação destes agregados αS heterogéneos dentro do coacervado electrostático líquido.A formação de agregados αS/Tau441 foi observada apenas no interior dos coacervados, que retiveram propriedades líquidas, e nunca, se os coacervados/gotículas não atingissem o estado de gel.Neste último caso, o aumento da força das interações eletrostáticas e, como resultado, a rigidez da rede proteica impedem os rearranjos conformacionais necessários das proteínas para estabelecer novas interações proteicas necessárias para a nucleação amilóide.No entanto, isto pode ser conseguido em coacervados mais flexíveis, semelhantes a líquidos, que por sua vez têm maior probabilidade de permanecer líquidos à medida que aumentam de tamanho.
O fato de a formação de agregados dentro da fase condensada ser preferível em grandes condensados ​​αS/Tau do que em pequenas gotículas que gelificam rapidamente, destaca a relevância de identificar os fatores que controlam a coalescência das gotículas.Assim, não só existe uma tendência à separação de fases, mas o tamanho do condensado deve ser controlado para o bom funcionamento e também para a prevenção de doenças58,61.Nossos resultados também destacam a importância do equilíbrio entre LLPS e LSPT para o sistema αS/Tau.Embora a formação de gotículas possa proteger contra a agregação amilóide, reduzindo a quantidade de monômeros proteicos disponíveis sob condições de saturação, como foi proposto em outros sistemas63,64, a fusão de gotículas em altos níveis de gotículas pode levar à agregação interna de proteínas através de rearranjos conformacionais lentos.redes de proteínas..
No geral, nossos dados enfatizam fortemente a relevância da valência coesa e das interações satisfeitas/insatisfeitas em redes drop no contexto do LSPT.Em particular, mostramos que condensados ​​αS/Tau441 completos são capazes de fundir e nuclear eficientemente para formar heteroagregados semelhantes a amilóides que incluem ambas as proteínas e propor um mecanismo molecular baseado em nossos resultados experimentais.A co-agregação de duas proteínas no coacervado fluido αS/Tau que relatamos aqui pode de fato estar relacionada à co-localização de duas proteínas em inclusões, que são marcas registradas da doença, e pode contribuir para a compreensão da relação entre LLPS e agregação amilóide, abrindo caminho para PDI altamente carregada na neurodegeneração.
WT-αS monomérico, mutantes de cisteína (Q24C-αS, N122C-αS) e variantes ΔCt-αS (Δ101-140) foram expressos em E. coli e purificados como descrito anteriormente.DTT 5 mM foi incluído em todas as etapas na purificação de mutantes de αS cisteína para evitar a formação de ligações dissulfeto.Isoforma Tau441 (plasmídeo obtido de Addgene # 16316), variante ΔNt-Tau (Δ1-150, obtida por clonagem de IVA com primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) e variante AggDef-Tau (Δ275-311, purificada com primer GGCTC5) As culturas de E. coli foram cresceu até DO600 = 0,6-0,7 a 37°C e 180 rpm, e a expressão foi induzida com IPTG durante 3 horas a 37°C.Colher células a 11.500 xg por 15 min a 4 °C e lavar com tampão salino contendo NaCl 150 mM.Ressuspender o sedimento em tampão de lise (20 ml por 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidina 50 μM, copeptina 100 μM).A etapa de sonicação foi realizada em gelo com amplitude de 80% por 10 pulsos (1 min ligado, 1 min desligado).Não exceda 60 ml em um ultrassom.Os lisados ​​de E. coli foram aquecidos a 95°C durante 20 minutos, depois resfriados em gelo e centrifugados a 127.000xg por 40 minutos.O sobrenadante clarificado foi aplicado a uma membrana de 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) e dialisado contra 4 L de tampão de diálise (MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0,1 mM) por 10 horas.Uma coluna de troca catiônica de 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, EUA) foi equilibrada com tampão de equilíbrio (MES 20 mM, pH 6, 8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM, PMSF 0, 1 mM).O lisado de tau foi filtrado através de um filtro PVDF de 0,22 μm e injetado na coluna a uma vazão de 1 ml/min.A eluição foi realizada gradualmente, a tau foi eluída com tampão de eluição 15-30% (MES 20 mM, pH 6, 8, NaCl 1 M, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM, PMSF 0, 1 mM).As frações foram analisadas por SDS-PAGE, e quaisquer frações contendo uma banda com o peso molecular esperado de tau foram concentradas usando um filtro centrífugo de 10 kDa e substituídas por um tampão contendo HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM e DTT 2 mM para a concentração final de proteína foi de 100 μM.A solução proteica foi então passada através de um filtro PVDF de 0,22 μm, rapidamente congelada e armazenada a -80°C.A proteína K18 foi gentilmente cedida pelo Prof. Alberto Boffi.A pureza da preparação foi> 95%, conforme confirmado por SDS-PAGE e MALDI-TOF/TOF.Várias cisteínas foram marcadas quimicamente com AlexaFluor488-maleimida (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA) ou TEMPOL-maleimida (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canadá).foram confirmados por absorbância e MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau e K18 foram marcados com resíduos de cisteína nativa nas posições 191 e 322 usando Atto647N-maleimida (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Alemanha) seguindo o mesmo procedimento.Os mapas de carga líquida por resíduo para αS e Tau441 foram gerados usando CIDER66.
Poli-L-lisina sólida (pLK DP 90-110 de acordo com RMN do fornecedor, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, EUA) foi dissolvida em HEPES 10 mM, NaCl 100 mM, concentração de pH 7,4 a 10 mM, processo sonicado por 5 minutos em banho-maria ultrassônico e armazenar a -20°C.PEG-8, dextrano-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, EUA) e FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, EUA) são solúveis em água e amplamente distribuídos em tampão LLPS.A diálise remove sais contaminantes.Eles foram então filtrados através de um filtro de seringa com tamanho de poro de 0,22 μm, e suas concentrações foram calculadas usando um refratômetro (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, EUA).As amostras de LLPS foram preparadas à temperatura ambiente na seguinte ordem: tampão e extrusão foram misturados e tris(2-carboxietil)fosfina 1 mM (TCEP, Carbosynth, Compton, Reino Unido), 2,2,2,2-(Etano- 1, 2-diildinitrila) ácido tetraacético (EDTA, carboxinto) e uma mistura de inibidor de protease a 1% (PMSF 100 mM, benzimida 1 mM, leupeptina 5 μM).Em seguida, são adicionados αS e policatiões fundidos (opções pLK ou Tau).Para experimentos de séries temporais de tioflavina-T (ThT, Carbosynth, Compton, Reino Unido), use a concentração total de ThT como metade da concentração de αS.Misture delicadamente, mas completamente, as amostras para garantir que fiquem homogêneas.A concentração de cada componente variou de experimento para experimento, conforme descrito na seção Resultados.A azida foi utilizada na concentração de 0,02% (p/v) sempre que a duração do experimento excedeu 4 horas.Para todas as análises utilizando amostras LLPS, deixe a mistura equilibrar durante 5 minutos antes da análise.Para análise de dispersão de luz, 150 µl de amostras foram carregadas em microplacas de 96 poços não ligantes (µClear®, preto, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Áustria) e cobertas com filme adesivo.Os LLPs foram monitorizados medindo a absorvância a 350 nm no centro da solução num leitor de placas CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemanha).Os experimentos foram realizados em triplicata a 25°C e os erros foram calculados como o desvio padrão da média.A fase diluída foi quantificada por centrifugação da amostra e análise de gel SDS-PAGE, e a fração αS nas fases diluída e concentrada foi quantificada em várias soluções LLPS.Uma amostra de 100 μl de LLPS contendo 1 μM de αS marcada com AF488 foi preparada por mistura completa seguida de centrifugação a 9600xg por 30 minutos, após o que o precipitado era geralmente visível.Os 50 μl superiores do sobrenadante foram utilizados para quantificação de proteínas usando gel SDS-PAGE.Os géis foram escaneados com filtros AF488 usando um sistema de imagem em gel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) ou corados com corante Coomassie e visualizados com filtros apropriados.As bandas resultantes foram analisadas utilizando o ImageJ versão 1.53i (National Institutes of Health, EUA).Os experimentos foram realizados em duplicata em dois experimentos diferentes com resultados semelhantes.
Normalmente, 150 μl de amostras foram aplicados em microplacas de 96 poços não ligantes e visualizadas à temperatura ambiente num microscópio invertido Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha).Para experiências pontuais, também foram utilizadas placas µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemanha) ou microplacas de poliestireno de 96 poços (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Lâmpadas halógenas ou de iodetos metálicos de mercúrio EL6000 foram usadas como fontes de iluminação (para imagens BF / DIC e WF, respectivamente).Para microscopia WF, uma objetiva aérea com ampliação de 40x (Leica Microsystems, Alemanha) foi usada para focar a luz na amostra e coletá-la.Para amostras marcadas com AF488 e ThT, filtre a excitação e a emissão com conjuntos de filtros GFP padrão, filtros passa-banda de excitação e emissão, respectivamente, filtros passa-banda de 460–500 nm e 512–542 nm e um espelho dicróico de 495 nm.Para amostras marcadas com Atto647N, foi utilizado um conjunto padrão de filtros Cy5 com filtros passa-banda de excitação e emissão de 628–40 nm e 692–40 nm, respectivamente, e um espelho dicróico de 660 nm.Para microscopia BF e DIC, use a mesma objetiva de coleta de luz refletida.A luz coletada foi registrada em uma câmera CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Alemanha).O tempo de exposição foi de 50 ms para imagens de microscopia BF e DIC e 20-100 ms para imagens de microscopia WF.Para efeito de comparação, o tempo de exposição para todos os experimentos com ThT foi de 100 ms.Experimentos de lapso de tempo foram realizados para visualizar a coalescência de gotículas, com imagens sendo coletadas a cada 100 ms durante vários minutos.ImageJ (NIH, EUA) foi utilizado para análise de imagens.Os experimentos foram realizados em triplicata com resultados semelhantes.
Para experimentos de colocalização, FRAP e reconstrução 3D, as imagens foram adquiridas em um microscópio confocal invertido Zeiss LSM 880 usando uma edição azul ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemanha).Amostras de 50 µl foram aplicadas em placas de Petri µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Alemanha), tratadas com um polímero hidrofílico (ibiTreat) e montadas em uma objetiva de imersão em óleo 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) no DIC).As imagens foram adquiridas usando linhas de laser de argônio de 458 nm, 488 nm e 633 nm com resolução de 0,26 µm/pixel e tempo de exposição de 8 µs/pixel para janelas de detecção de excitação e emissão de 470–600 nm, 493–628 nm, e 638–755 nm foram usados ​​para visualizar ThT, AF488 e Atto647N, respectivamente.Para os experimentos FRAP, a fotografia time-lapse de cada amostra foi registrada a 1 quadro por segundo.As experiências foram realizadas em triplicado à temperatura ambiente com resultados semelhantes.Todas as imagens foram analisadas utilizando o software Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemanha).As curvas FRAP foram normalizadas, plotadas e ajustadas aos dados de intensidade/tempo extraídos de imagens usando Zen 2 usando OriginPro 9.1.As curvas de recuperação foram ajustadas a um modelo mono-exponencial para contabilizar a difusão molecular com um termo exponencial adicional para contabilizar o efeito de branqueamento de aquisição.Calculamos então D usando o raio nominal de branqueamento e a meia-vida de recuperação previamente determinada como na equação de Kang et al.5 35 mostrado.
Variantes de cisteína única de αS foram sintetizadas com 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-oxil (TEMPOL) nas posições 24 (TEMPOL-24-αS) e 122 (TEMPOL-122-αS), respectivamente.Rotulagem Spin Para experimentos de EPR, a concentração de αS foi fixada em 100 μM e a concentração de PEG foi de 15% (p/v).Para várias condições de agregação, a razão αS:pLK foi de 1:10, enquanto as razões αS:ΔNt-Tau e αS:Tau441 foram mantidas em 1:1.Para experimentos de titulação de ligação na ausência de aglomeração, o TEMPOL-122-αS foi mantido a 50 μM e os policatiões foram titulados em concentrações crescentes, preparando cada condição separadamente.As medições CW-EPR foram realizadas usando um espectrômetro de banda X Bruker ELEXSYS E580 equipado com um ressonador Bruker ER4118 SPT-N1 operando em uma frequência de micro-ondas (SHF) de ~ 9, 7 GHz.A temperatura foi fixada em 25°C e controlada por um criostato de nitrogênio líquido.Os espectros foram obtidos em condições não saturadas com potência MW de 4 mW, amplitude de modulação de 0,1 mT e frequência de modulação de 100 kHz.As intensidades espectrais foram normalizadas para evitar diferenças nas concentrações de spin entre amostras e possível redução de spin devido a concentrações residuais de agentes redutores em amostras contendo Tau441 ou ΔNt-Tau (presentes nas soluções proteicas originais).Os valores de g fornecidos foram obtidos como resultado da modelagem espectral EPR realizada no software Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) implementado em Matlab®67.Modelos isotrópicos de um/dois componentes foram usados ​​para modelar os dados.Após normalizar todos os sinais, os resíduos foram calculados subtraindo cada simulação do espectro experimental correspondente.Para análise de titulação de ligação, a intensidade relativa da terceira banda à segunda banda do espectro EPR normalizado (IIII/III) foi utilizada para monitorar a ligação de policatiões a αS.Para estimar a constante de dissociação (Kd), a curva resultante foi ajustada a um modelo aproximado assumindo n sítios de ligação idênticos e independentes.
As experiências de espectroscopia de RMN foram realizadas utilizando um espectrómetro de RMN Bruker Neo 800 MHz (1H) equipado com uma criossonda e gradiente Z.Todas as experiências foram realizadas utilizando αS 130-207 µM e equivalentes αS/ΔNt-Tau e pLK correspondentes em HEPES 10 mM, NaCl 100 mM, D2 10%, pH 7,4 e foram realizadas a 15°C.Para monitorar o LPS por RMN, foi adicionado PEG a 10% às amostras pré-misturadas.O gráfico de perturbação do deslocamento químico (Fig. 1b) mostra os deslocamentos químicos médios de 1H e 15N.Os espectros αS 2D1H-15N HSQC foram atribuídos com base em uma atribuição anterior (entrada BMRB #25227) e confirmados registrando e analisando os espectros 3D de HNCA, HNCO e CBCAcoNH.Os desvios químicos 13Cα e 13Cβ foram calculados na presença de ΔNt-Tau ou pLK para medir possíveis mudanças nas tendências da estrutura secundária em comparação com os desvios químicos αS na conformação pura da bobina aleatória 68 (Figura 5c suplementar).As taxas R1ρ foram medidas registrando experimentos hsqctretf3gpsi (obtidos da biblioteca Bruker) com atrasos de 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 e 800 ms, e as funções exponenciais foram ajustadas para os atrasos de intensidade de pico em diferentes vezes para determinar o R1ρ e sua incerteza experimental.
Experimentos de microscopia de fluorescência resolvida no tempo de duas cores foram realizados em um microscópio confocal de fluorescência MT200 comercial resolvido no tempo (PicoQuant, Berlim, Alemanha) com um dispositivo de contagem de fótons únicos correlacionado no tempo (TCSPC).A cabeça do diodo laser é usada para excitação intercalada pulsada (PIE), o feixe passa através de um guia de ondas de modo único e é sintonizado para uma potência de laser de 10 a 100 nW para linhas de laser de 481 nm e 637 nm medidas após um espelho dicróico.Isso garante uma taxa ideal de contagem de fótons, evitando os efeitos de aliasing de fótons, fotodegradação e saturação.Lamelas ou placas de angiogênese μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemanha) foram colocadas diretamente em água de imersão sobre uma lente Super Apochromat 60x NA 1.2 com colar corretivo (Olympus Life Sciences, Waltham, EUA).Um espelho dicróico de 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, EUA) foi utilizado como divisor de feixe principal.A radiação não focada é bloqueada por um orifício com diâmetro de 50 mícrons e, em seguida, a radiação focada é dividida em 2 caminhos de detecção por um divisor de feixe 50/50.Filtros de emissão passa-faixa (Semrock, Lake Forest, IL, EUA) 520/35 para corante verde (AF488) e 690/70 para corante vermelho (Atto647N) foram utilizados na frente do detector.Diodos de avalanche de fóton único (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Itália) foram utilizados como detectores.Tanto a coleta quanto a análise de dados foram realizadas utilizando o software SymphoTime64 disponível comercialmente (PicoQuant GmbH, Berlim, Alemanha).
Cinquenta microlitros de amostras LLPS foram aplicados em poços de angiogênese μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemanha).As imagens resultantes são focadas a 20 μm acima do fundo do poço para uma distância de trabalho objetiva ideal para gotículas suspensas e a ~ 1 μm para jangadas e pontos com uma resolução axial de pelo menos 0,25 μm/pixel e um tempo de atraso de 400 μs/pixel.Selecione os dados aplicando um limite de intensidade com base na intensidade média do sinal de fundo (PBG, média + 2σ) para cada canal, de modo que apenas gotículas, jangadas ou manchas de proteína líquida sejam selecionadas, filtrando qualquer origem possível da fase dispersa.Para analisar a vida útil de cada espécie (τ) de cada canal (verde, “g” para AF488 e vermelho, “r” para Atto647N), selecionamos regiões de interesse (ROIs) contendo gotículas, jangadas ou manchas (Figura Suplementar 1 ).8b) e os derivou ajustando seu decaimento de vida (τD, τR e τP para gotículas, jangadas ou manchas, respectivamente, ver Figura 8c suplementar) em cada canal usando uma análise de ajuste de cauda e um modelo de decaimento de dois componentes.Média τ de τ .ROIs que produziram poucos fótons para um ajuste multiexponencial foram excluídos da análise.O ponto de corte utilizado foi <104 fótons para jangadas e pontos e 103 para gotas.As gotículas possuem um limiar mais baixo porque é difícil obter curvas de decaimento com valores de intensidade mais elevados, uma vez que as gotículas no campo da imagem são geralmente menores e menos numerosas.ROIs com contagens de fótons acima do limite de acumulação de fótons (definido como >500 contagens/pixel) também foram descartadas para análise.Combine a curva de decaimento de intensidade obtida na região de interesse com uma intensidade de 90% do máximo (um pouco após a intensidade máxima do decaimento) desde o início da vida útil para garantir interferência mínima de IRF, mantendo a mesma para todos os decaimentos de intensidade configurações Janela de tempo relativa Foram analisados ​​25 a 50 ROI para jangadas e spots e 15-25 ROI para drops, imagens selecionadas de mais de 4 réplicas registradas de pelo menos 3 experimentos independentes.Testes t bicaudais têm sido usados ​​para avaliar diferenças estatísticas entre espécies ou entre sistemas coacervados.Para uma análise pixel a pixel do tempo de vida (τ), foi calculada a atenuação total do tempo de vida ao longo do campo para cada canal e foi realizada uma aproximação de um modelo de atenuação exponencial de 2/3 componentes.A atenuação de vida útil para cada pixel foi então ajustada usando valores de τ previamente calculados, resultando em uma imagem de ajuste FLIM pseudocolorida.A faixa de vida útil do ajuste de cauda foi a mesma em todas as imagens do mesmo canal, e cada decaimento produziu fótons suficientes para fornecer um ajuste confiável.Para análise FRET, os pixels foram selecionados aplicando um limite de intensidade mais baixo de 100 fótons, com média de sinal de fundo (FBG) de 11 fótons.A intensidade de fluorescência de cada canal foi corrigida por fatores de correção determinados experimentalmente: 69 crosstalk espectral α foi 0,004, excitação direta β foi 0,0305, eficiência de detecção γ foi 0,517.A eficiência do FRET no nível do pixel é então calculada usando a seguinte equação:
onde FDD é a intensidade de fluorescência observada no canal doador (verde), FDA é a intensidade de fluorescência observada no canal aceitador (vermelho) sob excitação indireta e FAA é a intensidade de fluorescência observada no canal aceitador (vermelho) sob excitação direta ( TORTA).Pulsos de intensidade de fluorescência são observados no canal).
Coloque 100 μl de soluções de reação LLPS contendo 25 μM Tau441 monomérico não marcado (com ou sem 25 μM αS) em tampão LLPS (suplementado como acima) em microplacas de 96 poços não vinculativas com revestimento de folha adesiva e a formação de gotículas foi verificada por microscopia WF após equilíbrio.dentro de 10 minutos.Após 48 horas de incubação à temperatura ambiente, foi confirmada a presença de jangadas e manchas proteicas.Em seguida, remova cuidadosamente o líquido sobre as jangadas dos poços, em seguida, adicione 50 L de tampão de dissociação (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 1 M, DTT 1 mM) e incubar por 10 min.A alta concentração de sal garante que o LLPS não se repetirá devido ao PEG residual, e possíveis conjuntos de proteínas formados apenas por interações eletrostáticas serão desmontados.O fundo do poço foi então cuidadosamente raspado com uma ponta de micropipeta e a solução resultante foi transferida para um poço de observação vazio.Após incubação das amostras com 50 μM ThT por 1 h, a presença de manchas isoladas foi verificada por microscopia WF.Prepare fibrilas αS sonicadas incubando 300 μl de uma solução αS 70 μM em PBS com pH 7,4, azida de sódio 0,01% a 37 °C e 200 rpm em um agitador orbital por 7 dias.A solução foi então centrifugada a 9600xg por 30 min, o sedimento foi ressuspenso em PBS pH 7,4 e sonicado (1 min, ciclo de 50%, amplitude de 80% em um sonicador Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, EUA) amostras de fibrilas com uma distribuição de tamanho relativamente uniforme de pequenas fibrilas.
A análise FCS / FCCS e a detecção de coincidência de duas cores (TCCD) foram realizadas no mesmo microscópio confocal fluorescente resolvido no tempo MT200 (Pico-Quant, Berlim, Alemanha) usado para os experimentos de microscopia FLIM-FRET usando o modo PIE.A potência do laser para esses experimentos foi adicionada a 6,0 µW (481 nm) e 6,2 µW (637 nm).A combinação dessas potências de laser foi escolhida para produzir brilho semelhante para os pares de fluoróforos utilizados, ao mesmo tempo em que alcança taxas de contagem ideais e evita fotobranqueamento e saturação.Tanto a coleta quanto a análise dos dados foram realizadas utilizando o software SymphoTime64 versão 2.3 disponível comercialmente (PicoQuant, Berlim, Alemanha).
Amostras de agregados αS/Tau isolados obtidos usando LLPS são diluídas em tampão de isolamento até a concentração monomolecular apropriada (normalmente uma diluição de 1:500, uma vez que os agregados já estão em baixas concentrações quando isolados de amostras de coacervado).As amostras foram aplicadas diretamente em lamínulas (Corning, EUA) pré-revestidas com solução de BSA na concentração de 1 mg/mL.
Para a análise PIE-smFRET nos canais verde e vermelho, um limiar de intensidade mais baixo de 25 fótons foi aplicado para filtrar sinais de baixa intensidade causados ​​por eventos monoméricos (observe que os monômeros superam as amostras agregadas em comparação com os agregados isolados).Este limite foi calculado como cinco vezes a intensidade média do αS monomérico obtido a partir da análise de amostras de monômeros puros, a fim de selecionar especificamente agregados para análise.O circuito de acionamento PIE, juntamente com a aquisição de dados TSCPC, permitiu a aplicação de um filtro de ponderação vitalício que ajuda a eliminar diafonias espectrais e de fundo.A intensidade do flare selecionada usando os limites acima foi corrigida usando o sinal de fundo médio determinado a partir dos histogramas de ocorrência versus intensidade/compartimento das amostras somente de buffer.As rajadas associadas a grandes agregados normalmente ocupam vários compartimentos consecutivos no rastreamento de tempo (definido como 1 ms).Nestes casos, optou-se por um silo de máxima resistência.Para análise FRET e estequiométrica, foi utilizado o fator gama γ teoricamente determinado (0,517).As contribuições espectrais de crosstalk e excitação direta são insignificantes (determinadas experimentalmente) na potência do laser de excitação usada.A eficiência e a estequiometria do FRET em uma explosão são calculadas da seguinte forma.