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SPACA6 é uma proteína de superfície expressa no esperma que é crítica para a fusão dos gametas durante a reprodução sexual dos mamíferos.Apesar deste papel fundamental, a função específica do SPACA6 é pouco compreendida.Nós elucidamos a estrutura cristalina do domínio extracelular de SPACA6 com uma resolução de 2,2 Å, revelando uma proteína de dois domínios composta por um feixe de quatro fitas e sanduíches β semelhantes a Ig unidos por ligantes quase flexíveis.Esta estrutura se assemelha a IZUMO1, outra proteína associada à fusão de gametas, tornando SPACA6 e IZUMO1 membros fundadores da superfamília de proteínas associadas à fertilização aqui referida como superfamília IST.A superfamília IST é estruturalmente definida por seu feixe torcido de quatro hélices e um par de motivos CXXC ligados por dissulfeto.Uma pesquisa AlphaFold baseada na estrutura do proteoma humano identificou membros proteicos adicionais desta superfamília;notavelmente, muitas dessas proteínas estão envolvidas na fusão dos gametas.A estrutura SPACA6 e a sua relação com outros membros da superfamília IST fornecem o elo que faltava no nosso conhecimento da fusão de gametas de mamíferos.
Toda vida humana começa com dois gametas haplóides separados: o espermatozóide do pai e o óvulo da mãe.Esse espermatozoide é vencedor de um intenso processo de seleção durante o qual milhões de espermatozoides passam pelo trato genital feminino, superam diversos obstáculos1 e passam por capacitação, o que potencializa sua motilidade e o processo dos componentes de superfície2,3,4.Mesmo que o espermatozoide e o óvulo se encontrem, o processo ainda não terminou.O oócito é circundado por uma camada de células do cumulus e uma barreira glicoproteica chamada zona pelúcida, através da qual os espermatozoides devem passar para entrar no oócito.Os espermatozóides utilizam uma combinação de moléculas de adesão superficial e enzimas secretadas e associadas à membrana para superar essas barreiras finais5.Estas moléculas e enzimas são armazenadas principalmente na membrana interna e na matriz acrossomal e são detectadas quando a membrana externa do esperma é lisada durante a reação acrossômica6.A etapa final nesta intensa jornada é o evento de fusão espermatozoide-óvulo, no qual as duas células fundem suas membranas para se tornarem um único organismo diplóide7.Embora este processo seja inovador na reprodução humana, as interações moleculares necessárias são pouco compreendidas.
Além da fertilização dos gametas, a química da fusão de duas bicamadas lipídicas tem sido extensivamente estudada.Em geral, a fusão de membranas é um processo energeticamente desfavorável que requer que um catalisador proteico sofra uma mudança de conformação estrutural que aproxima duas membranas, quebrando sua continuidade e causando a fusão8,9.Esses catalisadores proteicos são conhecidos como fusogênios e foram encontrados em inúmeros sistemas de fusão.Eles são necessários para a entrada viral nas células hospedeiras (por exemplo, gp160 no HIV-1, pico nos coronavírus, hemaglutinina nos vírus influenza)10,11,12 placentários (sincitina)13,14,15 e fusões formadoras de gametas em eucariotos inferiores ( HAP2/GCS1 em plantas, protistas e artrópodes) 16,17,18,19.Os fusogênios para gametas humanos ainda não foram descobertos, embora várias proteínas tenham demonstrado ser críticas para a ligação e fusão dos gametas.O CD9 expresso em oócitos, uma proteína transmembrana necessária para a fusão de gametas humanos e de camundongos, foi o primeiro a ser descoberto 21,22,23.Embora a sua função precisa permaneça obscura, parece provável um papel na adesão, na estrutura dos focos de adesão nas microvilosidades do ovo e/ou na localização correta das proteínas da superfície do oócito 24,25,26.As duas proteínas mais típicas que são críticas para a fusão dos gametas são a proteína do esperma IZUMO127 e a proteína do oócito JUNO28, e sua associação mútua é um passo importante no reconhecimento e adesão dos gametas antes da fusão.Camundongos knockout Izumo1 machos e camundongos knockout fêmeas Juno são completamente estéreis; nesses modelos, os espermatozoides entram no espaço perivitelino, mas os gametas não se fundem.Da mesma forma, a confluência foi reduzida quando os gametas foram tratados com anticorpos anti-IZUMO1 ou JUNO27,29 em experimentos de fertilização in vitro em humanos.
Recentemente, foi descoberto um grupo recém-descoberto de proteínas expressas em espermatozoides fenotipicamente semelhantes a IZUMO1 e JUNO20,30,31,32,33,34,35.A proteína 6 associada à membrana acrossomal do esperma (SPACA6) foi identificada como essencial para a fertilização em um estudo de mutagênese murina em larga escala.A inserção do transgene no gene Spaca6 produz espermatozóides não fusíveis, embora estes espermatozóides se infiltrem no espaço perivitelino 36 .Estudos subsequentes de nocaute em camundongos confirmaram que Spaca6 é necessário para a fusão de gametas 30,32.SPACA6 é expresso quase exclusivamente nos testículos e tem um padrão de localização semelhante ao de IZUMO1, nomeadamente na íntima dos espermatozóides antes da reacção acrossómica, e depois migra para a região equatorial após a reacção acrossómica 30,32.Os homólogos de Spaca6 existem em uma variedade de mamíferos e outros eucariotos 30 e sua importância para a fusão de gametas humanos foi demonstrada pela inibição da fertilização humana in vitro pela resistência ao SPACA6 30.Ao contrário do IZUMO1 e do JUNO, os detalhes da estrutura, interações e função do SPACA6 permanecem obscuros.
Para compreender melhor o processo fundamental subjacente à fusão de espermatozóides e óvulos humanos, que nos permitirá informar os desenvolvimentos futuros no planeamento familiar e no tratamento de fertilidade, conduzimos estudos estruturais e bioquímicos SPACA6.A estrutura cristalina do domínio extracelular de SPACA6 mostra um feixe de quatro hélices (4HB) e um domínio semelhante a imunoglobulina (semelhante a Ig) conectado por regiões quase flexíveis.Como previsto em estudos anteriores,7,32,37 a estrutura do domínio do SPACA6 é semelhante à do IZUMO1 humano, e as duas proteínas partilham um motivo invulgar: 4HB com uma superfície helicoidal triangular e um par de motivos CXXC ligados por dissulfureto.Propomos que IZUMO1 e SPACA6 definam agora uma superfamília maior e estruturalmente relacionada de proteínas associadas à fusão de gametas.Usando características exclusivas da superfamília, conduzimos uma busca exaustiva pelo proteoma humano estrutural AlphaFold, identificando membros adicionais desta superfamília, incluindo vários membros envolvidos na fusão e/ou fertilização de gametas.Parece agora que existe uma dobra estrutural comum e uma superfamília de proteínas associadas à fusão dos gametas, e nossa estrutura fornece um mapa molecular deste importante aspecto do mecanismo de fusão dos gametas humanos.
SPACA6 é uma proteína transmembrana de passagem única com um glicano ligado a N e seis supostas ligações dissulfeto (Figuras S1a e S2).Expressamos o domínio extracelular do SPACA6 humano (resíduos 27-246) em células de Drosophila S2 e purificamos a proteína usando afinidade de níquel, troca catiônica e cromatografia de exclusão de tamanho (Fig. S1b).O ectodomínio SPACA6 purificado é muito estável e homogêneo.A análise utilizando cromatografia de exclusão de tamanho combinada com dispersão de luz poligonal (SEC-MALS) revelou um pico com peso molecular calculado de 26,2 ± 0,5 kDa (Fig. S1c).Isto é consistente com o tamanho do ectodomínio monomérico SPACA6, indicando que a oligomerização não ocorreu durante a purificação.Além disso, a espectroscopia de dicroísmo circular (CD) revelou uma estrutura α/β mista com ponto de fusão de 51,3 °C (Fig. S1d, e).A desconvolução dos espectros de CD revelou 38,6% de elementos de fita α-helicoidal e 15,8% de fita β (Figura S1d).
O ectodomínio SPACA6 foi cristalizado usando semeadura de matriz aleatória resultando em um conjunto de dados com resolução de 2,2 Å (Tabela 1 e Figura S3).Usando uma combinação de substituição molecular baseada em fragmentos e dados de faseamento SAD com exposição ao brometo para determinação da estrutura (Tabela 1 e Figura S4), o modelo refinado final consiste nos resíduos 27-246.No momento em que a estrutura foi determinada, não havia estruturas experimentais ou AlphaFold disponíveis.O ectodomínio SPACA6 mede 20 Å × 20 Å × 85 Å, consiste em sete hélices e nove cadeias β, e possui uma dobra terciária alongada estabilizada por seis ligações dissulfeto (Fig. 1a, b).A fraca densidade eletrônica no final da cadeia lateral Asn243 indica que este resíduo é uma glicosilação ligada a N.A estrutura consiste em dois domínios: um feixe de quatro hélices N-terminal (4HB) e um domínio semelhante a Ig C-terminal com uma região de dobradiça intermediária entre eles (Fig. 1c).
a Estrutura do domínio extracelular de SPACA6.Diagrama de faixas do domínio extracelular de SPACA6, a cor da cadeia do terminal N ao terminal C, de azul escuro a vermelho escuro.As cisteínas envolvidas em ligações dissulfeto são destacadas em magenta.b Topologia do domínio extracelular de SPACA6.Use o mesmo esquema de cores da Figura 1a.c Domínio extracelular SPACA6.Os gráficos de faixa de domínio 4HB, dobradiça e tipo Ig são coloridos em laranja, verde e azul, respectivamente.As camadas não são desenhadas em escala.
O domínio 4HB do SPACA6 inclui quatro hélices principais (hélices 1–4), que estão dispostas na forma de uma hélice helicoidal (Fig. 2a), alternando entre interações antiparalelas e paralelas (Fig. 2b).Uma pequena hélice adicional de volta única (hélice 1′) é colocada perpendicularmente ao feixe, formando um triângulo com as hélices 1 e 2. Este triângulo é ligeiramente deformado no empacotamento torcido helicoidal do empacotamento relativamente denso das hélices 3 e 4 ( Figura 2a).
Gráfico de tira N-terminal 4HB.b Vista superior de um feixe de quatro hélices, cada hélice destacada em azul escuro no terminal N e vermelho escuro no terminal C.c Diagrama de roda espiral de cima para baixo para 4HB, com cada resíduo mostrado como um círculo rotulado com um código de aminoácido de uma única letra;apenas os quatro aminoácidos no topo da roda são numerados.Os resíduos não polares são coloridos em amarelo, os resíduos polares sem carga são coloridos em verde, os resíduos carregados positivamente são coloridos em azul e os resíduos carregados negativamente são coloridos em vermelho.d Faces triangulares do domínio 4HB, com 4HBs em laranja e dobradiças em verde.Ambas as inserções mostram ligações dissulfeto em forma de bastonete.
O 4HB está concentrado em um núcleo hidrofóbico interno composto principalmente de resíduos alifáticos e aromáticos (Fig. 2c).O núcleo contém uma ligação dissulfeto entre Cys41 e Cys55 que liga as hélices 1 e 2 em um triângulo elevado superior (Fig. 2d).Duas ligações dissulfeto adicionais foram formadas entre o motivo CXXC na Hélice 1 'e outro motivo CXXC encontrado na ponta do grampo β na região da dobradiça (Fig. 2d).Um resíduo conservador de arginina com função desconhecida (Arg37) está localizado dentro de um triângulo oco formado pelas hélices 1′, 1 e 2. Os átomos de carbono alifáticos Cβ, Cγ e Cδ Arg37 interagem com o núcleo hidrofóbico e seus grupos guanidina se movem ciclicamente entre as hélices 1 ′ e 1 através de interações entre o esqueleto Thr32 e a cadeia lateral (Fig. S5a, b).Tyr34 se estende para dentro da cavidade deixando duas pequenas cavidades através das quais Arg37 pode interagir com o solvente.
Os domínios sanduíche β semelhantes a Ig são uma grande superfamília de proteínas que compartilham a característica comum de duas ou mais folhas β anfipáticas de cadeia múltipla interagindo através de um núcleo hidrofóbico 39. O domínio semelhante a Ig C-terminal de SPACA6 tem o mesmo padrão e consiste em duas camadas (Fig. S6a).A folha 1 é uma folha β de quatro fitas (fitas D, F, H e I) onde as fitas F, H e I formam um arranjo antiparalelo e as fitas I e D assumem uma interação paralela.A Tabela 2 é uma pequena folha beta de cadeia dupla antiparalela (cadeias E e G).Uma ligação dissulfeto interna foi observada entre o terminal C da cadeia E e o centro da cadeia H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Esta ligação dissulfeto é análoga à ligação dissulfeto no domínio sanduíche β da imunoglobulina .
A folha β de quatro fios torce ao longo de todo o seu comprimento, formando bordas assimétricas que diferem em forma e eletrostática.A borda mais fina é uma superfície ambiental hidrofóbica plana que se destaca em comparação com as demais superfícies irregulares e eletrostaticamente diversas no SPACA6 (Fig. S6b, c).Um halo de grupos carbonila/amino expostos e cadeias laterais polares circunda a superfície hidrofóbica (Fig. S6c).A margem mais larga é coberta por um segmento helicoidal coberto que bloqueia a porção N-terminal do núcleo hidrofóbico e forma três ligações de hidrogênio com o grupo polar aberto da estrutura da cadeia F (Fig. S6d).A porção C-terminal desta borda forma uma grande bolsa com um núcleo hidrofóbico parcialmente exposto.A bolsa é cercada por cargas positivas devido a três conjuntos de resíduos duplos de arginina (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 e Arg212-Arg214) e uma histidina central (His220) (Figura S6e).
A região de dobradiça é um segmento curto entre o domínio helicoidal e o domínio semelhante a Ig, consistindo em uma camada β antiparalela de três fitas (fitas A, B e C), uma pequena hélice 310 e vários longos segmentos helicoidais aleatórios.(Fig. S7).Uma rede de contatos covalentes e eletrostáticos na região de dobradiça parece estabilizar a orientação entre 4HB e o domínio semelhante a Ig.A rede pode ser dividida em três partes.A primeira parte inclui dois motivos CXXC (27CXXC30 e 139CXXC142) que formam um par de ligações dissulfeto entre o grampo β na dobradiça e a hélice 1 'em 4HB.A segunda parte inclui interações eletrostáticas entre o domínio semelhante a Ig e a dobradiça.Glu132 na dobradiça forma uma ponte salina com Arg233 no domínio semelhante a Ig e Arg135 na dobradiça.A terceira parte inclui uma ligação covalente entre o domínio semelhante a Ig e a região de dobradiça.Duas ligações dissulfeto (Cys124-Cys147 e Cys128-Cys153) conectam a alça de dobradiça a um ligante que é estabilizado por interações eletrostáticas entre Gln131 e o grupo funcional da estrutura principal, permitindo acesso ao primeiro domínio semelhante a Ig.corrente.
A estrutura do ectodomínio SPACA6 e estruturas individuais dos domínios 4HB e Ig-like foram utilizadas para procurar registros estruturalmente semelhantes em bancos de dados de proteínas 42 .Identificamos correspondências com altos escores Dali Z, pequenos desvios padrão e grandes escores LALI (sendo este último o número de resíduos estruturalmente equivalentes).Embora os primeiros 10 resultados da pesquisa completa de ectodomínio (Tabela S1) tivessem um escore Z aceitável> 842, uma pesquisa apenas por 4HB ou domínio semelhante a Ig mostrou que a maioria desses resultados correspondia apenas a sanduíches β.uma dobra onipresente encontrada em muitas proteínas.Todas as três pesquisas em Dali retornaram apenas um resultado: IZUMO1.
Há muito que se sugere que SPACA6 e IZUMO1 partilham semelhanças estruturais7,32,37.Embora os ectodomínios dessas duas proteínas associadas à fusão de gametas compartilhem apenas 21% de identidade de sequência (Figura S8a), evidências complexas, incluindo um padrão de ligação dissulfeto conservado e um domínio semelhante a Ig C-terminal previsto em SPACA6, permitiram tentativas iniciais de construir um modelo de homologia de A um camundongo SPACA6 usando IZUMO1 como modelo .Nossa estrutura confirma essas previsões e mostra o verdadeiro grau de similaridade.De fato, as estruturas SPACA6 e IZUMO137,43,44 compartilham a mesma arquitetura de dois domínios (Fig. S8b) com domínios sanduíche β semelhantes a 4HB e Ig conectados por uma região de dobradiça (Fig. S8c).
IZUMO1 e SPACA6 4HB têm diferenças comuns em relação aos feixes espirais convencionais.4HBs típicos, como aqueles encontrados nos complexos proteicos SNARE envolvidos na fusão endossomal 45,46, têm hélices uniformemente espaçadas mantendo uma curvatura constante em torno de um eixo central 47. Em contraste, os domínios helicoidais em IZUMO1 e SPACA6 foram distorcidos, com curvatura variável e embalagem irregular (Figura S8d).A torção, provavelmente causada pelo triângulo formado pelas hélices 1′, 1 e 2, é retida em IZUMO1 e SPACA6 e estabilizada pelo mesmo motivo CXXC na hélice 1′.No entanto, a ligação dissulfeto adicional encontrada em SPACA6 (Cys41 e Cys55 ligando covalentemente as hélices 1 e 2 acima) cria um ápice mais nítido no ápice do triângulo, tornando SPACA6 mais torcido que IZUMO1, com triângulos de cavidade mais pronunciados.Além disso, IZUMO1 não possui Arg37 observado no centro desta cavidade em SPACA6.Em contraste, IZUMO1 possui um núcleo hidrofóbico mais típico de resíduos alifáticos e aromáticos.
IZUMO1 possui um domínio semelhante a Ig que consiste em uma folha β de fita dupla e cinco fita .A fita extra em IZUMO1 substitui a bobina em SPACA6, que interage com a fita F para limitar as ligações de hidrogênio da estrutura principal na fita.Um ponto interessante de comparação é a carga superficial prevista dos domínios semelhantes a Ig das duas proteínas.A superfície IZUMO1 tem carga mais negativa do que a superfície SPACA6.Uma carga adicional está localizada perto do terminal C voltado para a membrana do esperma.No SPACA6, as mesmas regiões eram mais neutras ou carregadas positivamente (Fig. S8e).Por exemplo, a superfície hidrofóbica (bordas mais finas) e os poços carregados positivamente (bordas mais largas) em SPACA6 são carregados negativamente em IZUMO1.
Embora a relação e os elementos da estrutura secundária entre IZUMO1 e SPACA6 estejam bem preservados, o alinhamento estrutural dos domínios semelhantes a Ig mostrou que os dois domínios diferem na sua orientação geral um em relação ao outro (Fig. S9).O feixe espiral de IZUMO1 é curvado em torno do sanduíche β, criando a forma de “bumerangue” descrita anteriormente a cerca de 50° do eixo central.Em contraste, o feixe helicoidal no SPACA6 foi inclinado cerca de 10° na direção oposta.As diferenças nestas orientações são provavelmente devidas a diferenças na região da dobradiça.No nível da sequência primária, IZUMO1 e SPACA6 compartilham pouca semelhança de sequência na dobradiça, com exceção dos resíduos de cisteína, glicina e ácido aspártico.Como resultado, as ligações de hidrogênio e as redes eletrostáticas são completamente diferentes.Os elementos da estrutura secundária da folha β são compartilhados por IZUMO1 e SPACA6, embora as cadeias em IZUMO1 sejam muito mais longas e a hélice 310 (hélice 5) seja exclusiva de SPACA6.Estas diferenças resultam em diferentes orientações de domínio para duas proteínas semelhantes.
Nossa pesquisa no servidor Dali revelou que SPACA6 e IZUMO1 são as únicas duas estruturas determinadas experimentalmente armazenadas no banco de dados de proteínas que possuem esta dobra 4HB específica (Tabela S1).Mais recentemente, a DeepMind (Alphabet/Google) desenvolveu o AlphaFold, um sistema baseado em redes neurais que pode prever com precisão as estruturas 3D de proteínas a partir de sequências primárias .Pouco depois de resolvermos a estrutura SPACA6, o banco de dados AlphaFold foi lançado, fornecendo modelos de estrutura preditiva cobrindo 98,5% de todas as proteínas do proteoma humano .Usando nossa estrutura SPACA6 resolvida como modelo de busca, uma busca de homologia estrutural para o modelo no proteoma humano AlphaFold identificou candidatos com possíveis semelhanças estruturais com SPACA6 e IZUMO1.Dada a incrível precisão do AlphaFold na previsão de SPACA6 (Fig. S10a) - especialmente o ectodomínio de 1,1 Å rms em comparação com nossa estrutura resolvida (Fig. S10b) - podemos ter certeza de que as correspondências SPACA6 identificadas provavelmente serão precisas.
Anteriormente, o PSI-BLAST procurou o cluster IZUMO1 com três outras proteínas associadas ao esperma: IZUMO2, IZUMO3 e IZUMO450.AlphaFold previu que essas proteínas da família IZUMO se dobram no domínio 4HB com o mesmo padrão de ligação dissulfeto que IZUMO1 (Figuras 3a e S11), embora não possuam um domínio semelhante a Ig.Supõe-se que IZUMO2 e IZUMO3 sejam proteínas de membrana unilaterais semelhantes a IZUMO1, enquanto IZUMO4 parece ser secretado.As funções das proteínas IZUMO 2, 3 e 4 na fusão dos gametas não foram determinadas.Sabe-se que IZUMO3 desempenha um papel na biogênese do acrossomo durante o desenvolvimento dos espermatozóides51, e a proteína IZUMO forma um complexo50.A conservação das proteínas IZUMO em mamíferos, répteis e anfíbios sugere que sua função potencial é consistente com a de outras proteínas conhecidas associadas à fusão de gametas, como DCST1/2, SOF1 e FIMP.
Diagrama da arquitetura de domínio da superfamília IST, com domínios 4HB, dobradiça e semelhantes a Ig destacados em laranja, verde e azul, respectivamente.IZUMO4 possui uma região C-terminal exclusiva que parece preta.As ligações dissulfeto confirmadas e putativas são mostradas por linhas sólidas e pontilhadas, respectivamente.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) e TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) são exibidos na mesma faixa de cores do painel A. As ligações dissulfeto são mostradas em magenta.As hélices transmembranares TMEM95, IZUMO2 e IZUMO3 não são mostradas.
Ao contrário da proteína IZUMO, acredita-se que outras proteínas SPACA (isto é, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 e SPACA9) sejam estruturalmente diferentes de SPACA6 (Fig. S12).Apenas SPACA9 possui 4HB, mas não se espera que tenha a mesma orientação paralelo-antiparalela ou a mesma ligação dissulfeto que SPACA6.Apenas SPACA1 possui um domínio semelhante a Ig.AlphaFold prevê que SPACA3, SPACA4 e SPACA5 têm uma estrutura completamente diferente de SPACA6.Curiosamente, sabe-se também que o SPACA4 desempenha um papel na fertilização, mas em maior extensão do que o SPACA6, facilitando a interação entre o espermatozoide e a zona pelúcida do oócito52.
Nossa pesquisa AlphaFold encontrou outra correspondência para IZUMO1 e SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, uma única proteína transmembranar específica do esperma, torna os camundongos machos inférteis quando ablacionados 32,33.Os espermatozóides sem TMEM95 tinham morfologia, motilidade e capacidade normais de penetrar na zona pelúcida e se ligar à membrana do óvulo, mas não conseguiam se fundir com a membrana do oócito.Estudos anteriores mostraram que o TMEM95 compartilha semelhanças estruturais com o IZUMO133.De fato, o modelo AlphaFold confirmou que TMEM95 é um 4HB com o mesmo par de motivos CXXC que IZUMO1 e SPACA6 e a mesma ligação dissulfeto adicional entre as hélices 1 e 2 encontrada em SPACA6 (Fig. 3a e S11).Embora TMEM95 não possua um domínio semelhante a Ig, possui uma região com um padrão de ligação dissulfeto semelhante às regiões de dobradiça SPACA6 e IZUMO1 (Fig. 3b).No momento da publicação deste manuscrito, o servidor de pré-impressão relatou a estrutura do TMEM95, confirmando o resultado AlphaFold53.TMEM95 é muito semelhante a SPACA6 e IZUMO1 e já é conservado evolutivamente em anfíbios (Fig. 4 e S13).
A pesquisa PSI-BLAST utilizou os bancos de dados NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP e SOF1 para determinar a posição dessas sequências na árvore da vida.As distâncias entre os pontos de ramificação não são mostradas em escala.
A impressionante semelhança estrutural geral entre SPACA6 e IZUMO1 sugere que eles são membros fundadores de uma superfamília estrutural conservada que inclui as proteínas TMEM95 e IZUMO 2, 3 e 4.membros conhecidos: IZUMO1, SPACA6 e TMEM95.Como apenas alguns membros possuem domínios semelhantes a Ig, a marca registrada da superfamília IST é o domínio 4HB, que possui características únicas comuns a todas essas proteínas: 1) 4HB enrolado com hélices dispostas em uma alternância antiparalela/paralela (Fig. . 5a), 2) o feixe tem uma face triangular que consiste em duas hélices dentro do feixe e uma terceira hélice vertical (Fig. área-chave (Fig. 5c). O motivo CXXC, encontrado em proteínas semelhantes à tiorredoxina, é conhecido por funcionar como um sensor redox 54,55,56, enquanto o motivo nos membros da família IST pode estar associado a dissulfeto isomerases de proteínas, como ERp57, na fusão de gametas.
Os membros da superfamília IST são definidos por três características do domínio 4HB: quatro hélices alternando entre orientação paralela e antiparalela, faces de feixes helicoidais bat-triangulares e um motivo duplo ca CXXC formado entre pequenas moléculas.) Hélices N-terminais (laranja) e região de dobradiça β-gancho de cabelo (verde).
Dada a semelhança entre SPACA6 e IZUMO1, foi testada a capacidade do primeiro de se ligar a IZUMO1 ou JUNO.A interferometria de biocamada (BLI) é um método de ligação baseado em cinética que já foi usado para quantificar a interação entre IZUMO1 e JUNO.Após a incubação do sensor marcado com biotina com IZUMO1 como isca com alta concentração de analito JUNO, um sinal forte foi detectado (Fig. S14a), indicando uma alteração induzida pela ligação na espessura do biomaterial ligado à ponta do sensor.Sinais semelhantes (isto é, JUNO acoplado ao sensor como isca contra o analito IZUMO1) (Fig. S14b).Nenhum sinal foi detectado quando SPACA6 foi usado como analito contra IZUMO1 ligado ao sensor ou JUNO ligado ao sensor (Figura S14a, b).A ausência deste sinal indica que o domínio extracelular do SPACA6 não interage com o domínio extracelular do IZUMO1 ou JUNO.
Como o ensaio BLI é baseado na biotinilação de resíduos de lisina livres na proteína da isca, esta modificação pode impedir a ligação se resíduos de lisina estiverem envolvidos na interação.Além disso, a orientação da ligação em relação ao sensor pode criar obstáculos estéricos, de modo que ensaios convencionais de pull-down também foram realizados nos ectodomínios SPACA6, IZUMO1 e JUNO recombinantes.Apesar disso, o SPACA6 não precipitou com IZUMO1 marcado com His ou JUNO marcado com His (Fig. S14c, d), indicando nenhuma interação consistente com aquela observada em experimentos BLI.Como controle positivo, confirmamos a interação do JUNO com o His IZUMO1 marcado (Figuras S14e e S15).
Apesar da semelhança estrutural entre SPACA6 e IZUMO1, a incapacidade do SPACA6 de se ligar ao JUNO não é surpreendente.A superfície do IZUMO1 humano possui mais de 20 resíduos que interagem com o JUNO, incluindo resíduos de cada uma das três regiões (embora a maioria deles esteja localizada na região de dobradiça) (Fig. S14f).Destes resíduos, apenas um é conservado em SPACA6 (Glu70).Embora muitas substituições de resíduos mantivessem suas propriedades bioquímicas originais, o resíduo essencial Arg160 em IZUMO1 foi substituído pelo Asp148 carregado negativamente em SPACA6;estudos anteriores mostraram que a mutação Arg160Glu em IZUMO1 anula quase completamente a ligação ao JUNO43.Além disso, a diferença na orientação do domínio entre IZUMO1 e SPACA6 aumentou significativamente a área superficial do sítio de ligação JUNO da região equivalente em SPACA6 (Fig. S14g).
Apesar da necessidade conhecida de SPACA6 para fusão de gametas e de sua semelhança com IZUMO1, SPACA6 não parece ter uma função de ligação JUNO equivalente.Portanto, procuramos combinar nossos dados estruturais com evidências de importância fornecidas pela biologia evolutiva.O alinhamento de sequências de homólogos SPACA6 mostra a conservação da estrutura comum além dos mamíferos.Por exemplo, resíduos de cisteína estão presentes mesmo em anfíbios distantemente relacionados (Fig. 6a).Usando o servidor ConSurf, dados de retenção de alinhamento de múltiplas sequências de 66 sequências foram mapeados para a superfície SPACA6.Este tipo de análise pode mostrar quais resíduos foram conservados durante a evolução da proteína e indicar quais regiões de superfície desempenham um papel na função.
a Alinhamento de sequências de ectodomínios SPACA6 de 12 espécies diferentes preparadas usando CLUSTAL OMEGA.Segundo a análise do ConSurf, as posições mais conservadoras estão marcadas em azul.Os resíduos de cisteína estão destacados em vermelho.Os limites do domínio e os elementos da estrutura secundária são mostrados no topo do alinhamento, onde as setas indicam as cadeias β e as ondas indicam as hélices.Os identificadores de acesso NCBI contendo as sequências são: humano (Homo sapiens, NP_001303901), mandril (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), macaco-prego (Cebus mimic, XP_017359366), cavalo (Equus caballus, XP_023506102), orca (Orcinus orca3_23 XP_032_0 34).), ovelha (Ovis aries, XP_014955560), elefante (Loxodonta africana, XP_010585293), cachorro (Canis lupus familyis, XP_025277208), rato (Mus musculus, NP_001156381), diabo da Tasmânia (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0318), ornitorrinco, 8) , 61_89 e Sapo-boi (Bufo bufo, XP_040282113).A numeração é baseada na ordem humana.b Representação de superfície da estrutura SPACA6 com 4HB na parte superior e domínio semelhante a Ig na parte inferior, cores baseadas em estimativas de conservação do servidor ConSurf.As partes mais bem preservadas estão em azul, as partes moderadamente preservadas estão em branco e as menos preservadas estão em amarelo.cisteína roxa.Três patches de superfície que demonstram um alto nível de proteção são mostrados nos patches rotulados 1, 2 e 3. Um desenho animado 4HB é mostrado na inserção no canto superior direito (mesmo esquema de cores).
A estrutura SPACA6 possui três regiões superficiais altamente conservadas (Fig. 6b).O patch 1 abrange 4HB e a região de dobradiça e contém duas pontes dissulfeto CXXC conservadas, uma rede de dobradiça Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7) e três resíduos aromáticos externos conservados (Phe31, Tyr73, Phe137)).uma borda mais larga do domínio semelhante a Ig (Fig. S6e), que representa vários resíduos carregados positivamente na superfície do esperma.Curiosamente, este adesivo contém um epítopo de anticorpo que demonstrou anteriormente interferir na função SPACA6 30.A região 3 abrange a dobradiça e um lado do domínio semelhante a Ig;esta região contém prolinas conservadas (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) e resíduos polares/carregados voltados para fora.Surpreendentemente, a maioria dos resíduos na superfície do 4HB são altamente variáveis ​​(Fig. 6b), embora a dobra seja conservada em todo o homólogo SPACA6 (como indicado pelo conservadorismo do núcleo do feixe hidrofóbico) e além da superfamília IST.
Embora esta seja a menor região em SPACA6 com o menor número de elementos de estrutura secundária detectáveis, muitos remanescentes da região de dobradiça (incluindo a região 3) são altamente conservados entre os homólogos de SPACA6, o que pode indicar que a orientação do feixe helicoidal e do sanduíche β desempenha um papel.como conservador.No entanto, apesar das extensas ligações de hidrogênio e das redes eletrostáticas na região de dobradiça de SPACA6 e IZUMO1, evidências de flexibilidade intrínseca podem ser vistas no alinhamento das múltiplas estruturas permitidas de IZUMO137,43,44.O alinhamento dos domínios individuais se sobrepôs bem, mas a orientação dos domínios entre si variou de 50° a 70° do eixo central (Fig. S16).Para entender a dinâmica conformacional do SPACA6 em solução, foram realizados experimentos SAXS (Fig. S17a, b).A reconstrução ab initio do ectodomínio SPACA6 conformou-se a uma estrutura cristalina de bastonete (Fig. S18), embora o gráfico de Kratky mostrasse algum grau de flexibilidade (Fig. S17b).Esta conformação contrasta com IZUMO1, em que a proteína não ligada assume uma forma de bumerangue tanto na rede como em solução .
Para identificar especificamente a região flexível, a espectroscopia de massa de troca hidrogênio-deutério (H-DXMS) foi realizada no SPACA6 e comparada com dados obtidos anteriormente no IZUMO143 (Fig. 7a, b).SPACA6 é claramente mais flexível que IZUMO1, como indicado por uma maior troca de deutério em toda a estrutura após 100.000 s de troca.Em ambas as estruturas, a parte C-terminal da região de dobradiça mostra um alto nível de troca, o que provavelmente permite rotação limitada de domínios 4HB e semelhantes a Ig em relação uns aos outros.Curiosamente, a parte C-terminal da dobradiça SPACA6, consistindo no resíduo 147CDLPLDCP154, é uma região 3 altamente conservada (Fig. 6b), possivelmente indicando que a flexibilidade interdomínio é uma característica evolutivamente conservada do SPACA6.De acordo com a análise de flexibilidade, os dados de fusão térmica do CD mostraram que SPACA6 (Tm = 51,2°C) é menos estável que IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (Fig. S1e e S19).
imagens a H-DXMS de SPACA6 eb IZUMO1.A percentagem de troca de deutério foi determinada nos momentos indicados.Os níveis de troca hidrogênio-deutério são indicados por cores em uma escala de gradiente de azul (10%) a vermelho (90%).As caixas pretas representam áreas de alta troca.Os limites de 4HB, dobradiça e domínio semelhante a Ig observados na estrutura cristalina são mostrados acima da sequência primária.Os níveis de troca de deutério em 10 s, 1000 s e 100.000 s foram plotados em um gráfico sobreposto às superfícies moleculares transparentes de SPACA6 e IZUMO1.Partes de estruturas com nível de troca de deutério abaixo de 50% são coloridas de branco.As áreas acima de 50% de troca H-DXMS são coloridas em uma escala de gradiente.
O uso de estratégias genéticas CRISPR/Cas9 e de nocaute genético de camundongo levou à identificação de vários fatores importantes para a ligação e fusão de espermatozoides e óvulos.Além da interação bem caracterizada da estrutura IZUMO1-JUNO e CD9, a maioria das proteínas associadas à fusão dos gametas permanece estrutural e funcionalmente enigmática.A caracterização biofísica e estrutural do SPACA6 é outra peça do quebra-cabeça molecular de adesão/fusão durante a fertilização.
SPACA6 e outros membros da superfamília IST parecem ser altamente conservados em mamíferos, bem como em aves, répteis e anfíbios individuais;na verdade, pensa-se que o SPACA6 é até necessário para a fertilização no peixe-zebra 59. Esta distribuição é semelhante a outras proteínas associadas à fusão de gametas conhecidas, como DCST134, DCST234, FIMP31 e SOF132, sugerindo que esses fatores são deficientes em HAP2 (também conhecidas como GCS1) proteínas que são responsáveis ​​pela atividade catalítica de muitos protistas., plantas e artrópodes.Proteínas de fusão fertilizadas 60, 61. Apesar da forte semelhança estrutural entre SPACA6 e IZUMO1, o nocaute de genes que codificam qualquer uma dessas proteínas resultou em infertilidade em camundongos machos, indicando que suas funções na fusão de gametas não são duplicadas..De forma mais ampla, nenhuma das proteínas espermáticas conhecidas, necessárias para a fase de adesão da fusão, é redundante.
Permanece uma questão em aberto se o SPACA6 (e outros membros da superfamília IST) participam de junções intergaméticas, formam redes intragaméticas para recrutar proteínas importantes para pontos de fusão, ou talvez até atuem como fusógenos indescritíveis.Estudos de co-imunoprecipitação em células HEK293T revelaram uma interação entre IZUMO1 completo e SPACA632.No entanto, os nossos ectodomínios recombinantes não interagiram in vitro, sugerindo que as interações observadas em Noda et al.foram ambos deletados na construção (observe a cauda citoplasmática de IZUMO1, que se mostrou desnecessária para a fertilização62).Alternativamente, IZUMO1 e/ou SPACA6 podem exigir ambientes de ligação específicos que não reproduzimos in vitro, como conformações fisiologicamente específicas ou complexos moleculares contendo outras proteínas (conhecidas ou ainda não descobertas).Embora se acredite que o ectodomínio IZUMO1 medeie a ligação dos espermatozóides ao óvulo no espaço perivitelino, o propósito do ectodomínio SPACA6 não é claro.
A estrutura do SPACA6 revela diversas superfícies conservadas que podem estar envolvidas nas interações proteína-proteína.A parte conservada da região de dobradiça imediatamente adjacente ao motivo CXXC (designada Patch 1 acima) possui vários resíduos aromáticos voltados para fora que estão frequentemente associados a interações hidrofóbicas e de empilhamento π entre biomoléculas.Os lados largos do domínio semelhante a Ig (região 2) formam um sulco carregado positivamente com resíduos Arg e His altamente conservados, e anticorpos contra esta região foram previamente utilizados para bloquear a fusão de gametas 30.O anticorpo reconhece o epítopo linear 212RIRPAQLTHRGTFS225, que possui três dos seis resíduos de arginina e His220 altamente conservado.Não está claro se a disfunção se deve ao bloqueio desses resíduos específicos ou de toda a região.A localização desta lacuna perto do terminal C do sanduíche β indica interações cis com proteínas espermáticas vizinhas, mas não com proteínas oocitárias.Além disso, a retenção de um emaranhado rico em prolina altamente flexível (sítio 3) dentro da dobradiça pode ser o sítio de uma interação proteína-proteína ou, mais provavelmente, indicar a retenção de flexibilidade entre os dois domínios.O gênero é importante para o papel desconhecido do SPACA6.fusão de gametas.
SPACA6 possui propriedades de proteínas de adesão intercelular, incluindo sanduíches β semelhantes a Ig.Muitas proteínas adesivas (por exemplo, caderinas, integrinas, adesinas e IZUMO1) possuem um ou mais domínios sanduíche β que estendem proteínas da membrana celular até seus alvos ambientais63,64,65.O domínio semelhante a Ig do SPACA6 também contém um motivo comumente encontrado em sanduíches β de adesão e coesão: dupletos de fitas paralelas nas extremidades dos sanduíches β, conhecidos como grampos mecânicos .Acredita-se que este motivo aumenta a resistência às forças de cisalhamento, o que é valioso para proteínas envolvidas em interações intercelulares.No entanto, apesar desta semelhança com as adesinas, atualmente não há evidências de que o SPACA6 interaja com a clara do ovo.O ectodomínio SPACA6 é incapaz de se ligar ao JUNO, e as células HEK293T que expressam SPACA6, como mostrado aqui, dificilmente interagem com oócitos sem zona 32.Se o SPACA6 estabelecer ligações intergaméticas, essas interações podem exigir modificações pós-traducionais ou estabilização por outras proteínas espermáticas.Em apoio a esta última hipótese, os espermatozóides deficientes em IZUMO1 ligam-se aos oócitos, demonstrando que outras moléculas além de IZUMO1 estão envolvidas na etapa de adesão dos gametas 27 .
Muitas proteínas de fusão virais, celulares e de desenvolvimento têm propriedades que predizem sua função como fusogênios.Por exemplo, as glicoproteínas de fusão viral (classes I, II e III) possuem um peptídeo de fusão hidrofóbico ou alça na extremidade da proteína que é inserida na membrana do hospedeiro.O mapa de hidrofilicidade de IZUMO143 e a estrutura (determinada e prevista) da superfamília IST não mostraram nenhum peptídeo de fusão hidrofóbico aparente.Assim, se alguma proteína da superfamília IST funcionar como fusogénios, fá-lo de uma maneira diferente de outros exemplos conhecidos.
Em conclusão, as funções dos membros da superfamília de proteínas IST associadas à fusão de gametas permanecem um mistério tentador.Nossa molécula recombinante SPACA6 caracterizada e sua estrutura resolvida fornecerão informações sobre as relações entre essas estruturas compartilhadas e seu papel na ligação e fusão dos gametas.
A sequência de DNA correspondente ao ectodomínio SPACA6 humano previsto (número de acesso NCBI NP_001303901.1; resíduos 27-246) foi otimizada por códon para expressão em células de Drosophila melanogaster S2 e sintetizada como um fragmento de gene com a sequência que codifica Kozak (Eurofins Genomics)., o sinal de secreção BiP e as extremidades 5 'e 3' correspondentes para clonagem independente de ligação deste gene num vector de expressão pMT baseado num promotor de metalotioneína modificado para selecção com puromicina (pMT-puro).O vetor pMT-puro codifica um local de clivagem da trombina seguido por um marcador 10x-His C-terminal (Figura S2).
A transfecção estável do vetor SPACA6 pMT-puro em células de D. melanogaster S2 (Gibco) foi realizada de forma semelhante ao protocolo utilizado para IZUMO1 e JUNO43.As células S2 foram descongeladas e cultivadas em meio de Schneider (Gibco) suplementado com uma concentração final de 10% (v/v) de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor (Gibco) e 1X antibiótico antimicótico (Gibco).As células de passagem precoce (3,0 x 106 células) foram plaqueadas em poços individuais de placas de 6 poços (Corning).Após 24 horas de incubação a 27°C, as células foram transfectadas com uma mistura de 2 mg do vector SPACA6 pMT-puro e reagente de transfecção Effectene (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante.As células transfectadas foram incubadas durante 72 horas e depois colhidas com 6 mg/ml de puromicina.As células foram então isoladas do meio de Schneider completo e colocadas em meio Insect-XPRESS isento de soro (Lonza) para produção de proteínas em larga escala.Um lote de 1 L de cultura de células S2 foi cultivado até 8-10 x 106 ml-1 células em um balão Erlenmeyer de polipropileno de fundo plano ventilado de 2 L e depois esterilizado com uma concentração final de 500 µM de CuSO4 (Millipore Sigma) e filtrado estéril.induzido.As culturas induzidas foram incubadas a 27°C a 120 rpm durante quatro dias.
O meio condicionado contendo SPACA6 foi isolado por centrifugação a 5660xg a 4°C seguido por um sistema de filtração de fluxo tangencial Centramate (Pall Corp) com uma membrana MWCO de 10 kDa.Aplicar meio concentrado contendo SPACA6 a uma coluna de resina de agarose Ni-NTA de 2 ml (Qiagen).A resina Ni-NTA foi lavada com 10 volumes de coluna (CV) de tampão A e depois foi adicionado 1 CV de tampão A para dar uma concentração final de imidazol de 50 mM.SPACA6 foi eluído com 10 ml de tampão A suplementado com imidazol até uma concentração final de 500 mM.A trombina da classe de restrição (Millipore Sigma) foi adicionada diretamente ao tubo de diálise (MWCO 12-14 kDa) a 1 unidade por mg de SPACA6 vs. 1 L de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 e NaCl 150 mM (tampão B) para diálise.) a 4°C por 48 horas.O SPACA6 clivado por trombina foi então diluído três vezes para reduzir a concentração de sal e carregado numa coluna de troca catiónica MonoS 5/50 GL de 1 ml (Cytiva/GE) equilibrada com Tris-HCl 10 mM, pH 7,5.O trocador de cátions foi lavado com 3 OK de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, depois SPACA6 foi eluído com um gradiente linear de 0 a 500 mm de NaCl em 10 mm de Tris-HCl, pH 7,5 para 25 OK.Após cromatografia de troca iônica, o SPACA6 foi concentrado até 1 ml e eluído isocraticamente de uma coluna ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) equilibrada com tampão B. De acordo com o cromatograma, reunimos e concentramos frações contendo SPACA6.A pureza foi controlada por electroforese corada com Coomassie num gel de SDS-poliacrilamida a 16%.A concentração de proteína foi quantificada por absorbância a 280 nm usando a lei de Beer-Lambert e o coeficiente de extinção molar teórico.
SPACA6 purificado foi dialisado durante a noite contra fosfato de sódio 10 mM, pH 7,4 e NaF 150 mM e diluído para 0,16 mg/mL antes da análise por espectroscopia de CD.A varredura espectral de CDs com comprimento de onda de 185 a 260 nm foi coletada em um espectropolarímetro Jasco J-1500 usando cubetas de quartzo com comprimento de caminho óptico de 1 mm (Helma) a 25 ° C a uma taxa de 50 nm/min.Os espectros de CD foram corrigidos na linha de base, calculada a média de 10 aquisições e convertidos em elipticidade residual média (θMRE) em graus cm2/dmol:
onde MW é o peso molecular de cada amostra em Da;N é o número de aminoácidos;θ é a elipticidade em miligraus;d corresponde ao comprimento do caminho óptico em cm;concentração de proteína em unidades.