310 10 * 1mm Componente químico de tubo enrolado de aço inoxidável. Os domínios N-terminais da spidroin formam hidrogéis baseados em fibrilas amilóides e fornecem uma plataforma para imobilização de proteínas.

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Especificação

310 fornecedores de tubos enrolados de aço inoxidável de 10 * 1 mm

Composição química

Propriedades mecânicas

As proteínas recombinantes da seda da aranha (proteínas da seda da aranha) têm muitas aplicações potenciais no desenvolvimento de novos biomateriais, mas a sua natureza multimodal e propensa à agregação torna-as difíceis de obter e fáceis de usar.Aqui relatamos que as proteínas espidroínas em miniatura recombinantes e, mais importante, o próprio domínio N-terminal (NT) formam rapidamente hidrogéis transparentes e autossustentáveis ​​a 37 ° C.proteínas de fusão que consistem em NT e proteína fluorescente verde ou nucleosídeo de purina fosforilase formam proteínas de fusão totalmente funcionais.Hidrogéis.Nossos resultados mostram que NT recombinantes e proteínas de fusão proporcionam altos rendimentos de expressão e conferem aos hidrogéis propriedades atraentes como transparência, gelificação sem reticulação e imobilização direta de proteínas ativas em alta densidade.
As aranhas têm até sete conjuntos diferentes de glândulas de seda, cada uma produzindo um tipo específico de seda.Todas as sete espécies de seda são compostas de proteínas de seda de aranha (spidroínas) com aproximadamente 6.000 resíduos de comprimento e contêm uma grande região central de repetição cercada por domínios esféricos N e C-terminais (NT e CT) .O tipo de seda mais amplamente estudado, a ampola primária, é produzida pela glândula ampola primária.Nesta glândula, uma monocamada de células epiteliais sintetiza proteínas espidroína e as secreta no lúmen da glândula, onde estão presentes em forma solúvel (dopagem) em concentrações extremamente altas (30–50% p/v)3,4.A organização e conformação das principais proteínas ampulares da espidroína na glândula têm sido debatidas, mas a maioria das evidências experimentais indicam a presença de uma conformação helicoidal geralmente helicoidal e/ou aleatória e estruturas micelares ou lamelares5,6,7,8,9,10.Enquanto os domínios repetitivos regulam as propriedades mecânicas das fibras de seda, formando nanocristais de folhas β e estruturas amorfas, os domínios terminais regulam as fibras de seda em resposta às mudanças nas condições ao longo da glândula de seda .Ao controlar a formação de seda, 19. Os domínios terminais são conservados evolutivamente e a sua função pode ser comum a todas as proteínas espidroína 2,20,21.Durante a passagem pela glândula, o pH da espidroína diminui de cerca de 7,6 para < 5,716 e aumenta com o cisalhamento e o estiramento mediados pelo movimento através do ducto que se estreita gradualmente.Em solução, o CT é um dímero paralelo constitutivo α-helicoidal , mas em resposta ao baixo pH e às forças de cisalhamento, o CT se desdobra e troca as camadas β , possivelmente desencadeando camadas β nas regiões repetitivas do Convert 16. NT são monoméricos sob condições que refletem as condições no lúmen da glândula e medeiam a solubilidade da espidroína, mas em pH reduzido, a protonação de uma série de cadeias laterais de ácido carboxílico leva à dimerização do NT com um pKa de aproximadamente 6,5, estabilizando assim o NT e fixando a espidroína em grandes quantidades.redes16,18.Assim, a NT desempenha papel fundamental na formação do filamento, passando de um monômero no revestimento para um dímero na fibra23,24,25.O NT permanece altamente solúvel e helicoidal sob todas as condições estudadas até o momento , o que inspirou seu desenvolvimento como um rótulo que aumenta a solubilidade para a produção de proteínas heterólogas.
A proteína de seda de miniaranha recombinante, consistindo de um NT, uma região de repetição curta, um CT e um marcador His6 (His-NT2RepCT) para purificação, é tão solúvel em tampão aquoso quanto a proteína de seda de aranha nativa e imita características nativas importantes da aranha de seda .cobertura 25.31.His-NT2RepCT pode ser fiado em fibras contínuas usando uma máquina biomimética na qual um revestimento solúvel com pH 8 é extrudado em um banho-maria com pH 525,32,33,34,35.A fermentação em biorreator de E. coli expressando His-NT2RepCT e subsequente pós-tratamento resultou em rendimento> 14 g/L após purificação.O alto rendimento, alta solubilidade e resposta adequada de His-NT2RepCT a condições ácidas são todos atribuídos ao NT23, 25, 34.
Aqui relatamos a rápida formação de hidrogéis transparentes a partir de proteínas spidroin recombinantes, incluindo apenas NT, por incubação de uma solução proteica a 37 °C.Usando fluorescência de tioflavina T (ThT), espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM), descobrimos que NT e proteínas de microaranha sofrem transformação estrutural em folhas β e fibrilas semelhantes a amilóides quando os géis são formados.Além disso, proteínas de fusão de NT e proteína fluorescente verde (GFP) ou nucleosídeo de purina fosforilase (PNP) formam hidrogéis com fragmentos de fusão totalmente funcionais.A expressão de alto rendimento em hospedeiros heterólogos, juntamente com a rápida formação de hidrogéis sob condições fisiológicas, abre a possibilidade de produção econômica de hidrogéis com funções de engenharia.
Ao contrário da maioria das proteínas espidroína recombinantes relatadas36, His-NT2RepCT é estável em tampão Tris-HCl em pH 8 e pode ser concentrado até 500 mg/mL sem precipitação25.Portanto, ficamos surpresos ao descobrir que esta proteína forma rapidamente hidrogéis auto-suportados e opticamente claros quando incubada a 37 ° C (Fig. 1b-d).Estudos adicionais mostraram que a gelificação de His-NT2RepCT ocorreu em uma ampla faixa de concentrações de proteína (10-300 mg/mL) e que esta concentração foi inversamente correlacionada com o tempo de gelificação (Fig. 1c e Figura 1 Complementar).Para descobrir quais partes de His-NT2RepCT medeiam a formação de hidrogel, examinamos então cada domínio individualmente e em várias combinações usando um ensaio de inversão de frasco (Figura 1a, b).Todas as frações testadas de espidroína recombinante formaram géis (a uma concentração de proteína de 300 mg/mL) em menos de 1 h, exceto o 2Rep precipitado (Fig. 1b).Isto sugere que NT e CT sozinhos, em combinação ou associados a repetições, podem gelificar a 37°C e que o marcador His6 não afeta este processo de forma significativa.Dada a noção comum de que o NT é uma proteína altamente solúvel e estável, e que relatórios anteriores de hidrogéis de spidroína recombinantes atribuíram efeitos de gelificação a alterações conformacionais em regiões repetidas e/ou CTs, o próprio NT poderia.A descoberta da gelificação foi inesperada.Tabela Suplementar 1) 37, 38, 39. Notavelmente, o NT já gelificou em 10 minutos a uma concentração de ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c).Experimentos de inversão de frascos com várias concentrações de NT mostraram que em> 50 mg/mL a solução de NT gelificou mais rapidamente que His-NT2RepCT na concentração correspondente (p/v, Figura 1c).
Representação esquemática de várias construções de espidroína estudadas neste trabalho.b Tempo de gelificação a 37 °C para várias proteínas spidroin recombinantes (300 mg/mL) verificado invertendo o frasco.Gel CT imediatamente sem incubação (<300 mg/mL), precipitados 2Rep (300 mg/mL, escala de 5 mm).c Tempo de gel de His-NT2RepCT e NT nas concentrações de proteína indicadas a 37°C.d Fotografias de hidrogéis His-NT2RepCT e NT com a aranha e a letra “NT” impressa por baixo, respectivamente (ambos 200 mg/mL, barra de escala 5 mm).
Os hidrogéis formados por várias proteínas espidroínas recombinantes têm cores ligeiramente diferentes, e a observação a olho nu mostra vários graus de transparência (Fig. 1b).Os géis NT são excepcionalmente transparentes, enquanto outros géis tornam-se opacos.Os géis His-NT2RepCT e NT moldados em tubos cilíndricos podem ser removidos intactos do molde (Fig. 1d).
Para testar se os revestimentos naturais de seda de aranha gelificam sob condições agora consideradas causadoras da gelificação das proteínas spidroína recombinantes, os revestimentos foram coletados da grande glândula ampola da aranha-ponte sueca (Larinioides sclopetarius).Os revestimentos foram armazenados em tampão Tris-HCl 20 mM a 50 mg/mL (com base no peso seco medido), mas nenhuma gelificação foi observada durante os 21 dias de incubação a 37 °C (Figura 2a suplementar).
Para quantificar estes géis, medições reológicas podem ser usadas para estudar o processo de gelificação e determinar as propriedades mecânicas globais.Em particular, a monitorização do módulo de armazenamento (elasticidade) a temperaturas elevadas pode fornecer informações sobre a temperatura de gelificação, bem como sobre as propriedades viscoelásticas do revestimento.Experimentos de aumento de temperatura (usando 1°C/min a 25-45°C, com base em estudos anteriores utilizando soluções estoque de seda natural)40,41 mostraram que os módulos de armazenamento das soluções His-NT2RepCT e NT aumentaram com o aumento da temperatura.foi aumentado (Fig. 2 e Fig. Complementar 3).Notavelmente, o módulo NT começou a crescer a uma temperatura mais baixa em comparação com His-NT2RepCT, consistente com o tempo de gel mais rápido observado quando o NT foi incubado diretamente com His-NT2RepCT a 37°C (Figura 1).Após uma queda subsequente na temperatura, o módulo de armazenamento não retornou a valores mais baixos e permaneceu acima do módulo de perda (ver Figura 3 suplementar), indicando gelificação estável termicamente irreversível.Após a gelificação, o módulo de elasticidade final variou de 15 a 330 kPa para hidrogéis His-NT2RepCT em uma concentração de 100–500 mg/mL, e o módulo de elasticidade final para hidrogéis NT (100–500 mg/mL) variou de 2 a 1400 kPa (Fig., 2 e dados de rampa completos) ver Figura Complementar 3).
a Mudança de temperatura durante medições de His-NT2RepCT (300 mg/mL) e b NT (300 mg/mL) com agitação.As setas indicam a tendência da temperatura, e o sombreamento mais claro dos dados do módulo de armazenamento mostra testes com valores de torque do instrumento mais baixos do que os especificados pelo fabricante, o que é a causa do aumento do ruído.c Acúmulo no módulo final de His-NT2RepCT e NT após temperatura elevada (100, 300 e 500 mg/mL).Todas as leituras do módulo são feitas a uma frequência de 0,1 Hz.
Como um método potencial para investigar alterações conformacionais associadas à gelificação, registramos espectros de FTIR de His-NT2RepCT e NT antes e depois da gelificação a 37 ° C (Figura 3a, b).Como esperado, os espectros das soluções His-NT2RepCT e NT corresponderam a proteínas apresentando estrutura secundária em hélice α/espiral aleatória, com banda pronunciada em 1645 cm-1.Para ambos os hidrogéis, a gelificação resultou na formação de dois braços na banda I média a cerca de 1617 cm-1 e 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), indicando a formação de estruturas de folha β antiparalelas.Essas mudanças também podem ser claramente vistas nos respectivos espectros de gelificação de segunda derivada e diferença (Figura 4b suplementar).As duas bandas da camada β do NT foram mais pronunciadas que as do His-NT2RepCT, indicando que o conteúdo total de bandas da camada β no hidrogel NT foi maior que o do hidrogel NT2RepCT.
a espectros de absorção FTIR de His-NT2RepCT e b NT (ambos 500 mg/mL) antes (solução) e depois (gel) incubação a 37°C.c Imagens TEM de géis NT2RepCT ressuspensos de 50 mg/ml e d NT.Barra de escala 200 nm.e Diâmetros das fibras dos hidrogéis His-NT2RepCT e NT.n = 100 fibrilas medidas, p < 0,0001.As barras de erro mostram o desvio padrão.O centro das barras de erro é a média.Um teste t não pareado (bicaudal) foi utilizado para análise estatística.f Fluorescência ThT de várias proteínas spidroin recombinantes (100 mg/mL) a 37 °C sem agitação.g de experimentos de inoculação de NT (100 mg/mL) a partir de gel de NT de 100 mg/mL com 0%, 5%, 10% e 20% de sementes.
A análise do gel utilizando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) mostrou que o hidrogel consiste em fibrilas semelhantes a amilóides (Figs. 3c, 3d).As fibrilas formadas por NT eram alongadas (5–12 nm de diâmetro) e não ramificadas, enquanto as fibrilas His-NT2RepCT eram mais curtas em comprimento e significativamente mais largas em diâmetro (7–16 nm) (Fig. 3e).Esses resultados nos permitiram acompanhar a cinética da fibrose utilizando o ensaio de tioflavina T (ThT).Para todas as proteínas spidroin recombinantes, o sinal fluorescente aumentou quando as amostras foram incubadas a 37 ° C (Fig. 3f, Figura 5a Complementar).Consistente com este achado, o exame microscópico de NT e His-NT2RepCT sob condições de gelificação revelou um aumento uniforme na fluorescência de ThT sem acúmulo local perceptível de agregados positivos para ThT (Figura 5b, c suplementar).A formação de fibrilas positivas para ThT não foi acompanhada por um aumento na turbidez de NT e His-NTCT (Figura 5d suplementar), o que significa que uma rede de fibrilas no gel poderia se formar sem comprometer a clareza do gel.A semeadura pela adição de pequenas quantidades de fibrilas pré-formadas pode acelerar significativamente a formação de fibrilas de alguns amilóides, mas adicionando 5%, 10% ou 20% (p/p) de NT a uma solução de hidrocoagulantes de NT.efeito de semeadura (Fig. 3g).Talvez isso se deva ao fato de as fibrilas do hidrogel serem relativamente fixas e não poderem ser utilizadas como sementes.
O comportamento inesperado das proteínas spidroin recombinantes a altas temperaturas levou a estudos adicionais de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) para identificar alterações conformacionais associadas à formação de gel.Os espectros de RMN das soluções His-NT2RepCT registrados ao longo do tempo a 37 ° C mostraram que a CT ainda estava parcialmente dobrada, enquanto os sinais NT e 2Rep haviam desaparecido (Fig. 4a), sugerindo que foram principalmente NT e 2Rep que controlaram parcialmente a formação de His- Hidrogel NT2RepCT.O sinal CT também foi atenuado para 20% de sua intensidade original, sugerindo que o CT também é principalmente fixo e incorporado à estrutura do hidrogel.Para uma porção menor da CT, que é tão móvel quanto na amostra pré-incubada e, portanto, observada por solução de RMN, os espectros carecem de sinais para os primeiros 10 resíduos estruturados, possivelmente devido à difícil imobilização da porção ligada de His-NT2Rep.Os espectros de RMN do estado de hidrogéis -NT2RepCT revelaram a presença predominante de hélices α e camadas β e, em menor extensão, a conformação de bobina aleatória (Fig. 4b).A análise do desvio químico dos resíduos de metionina presentes apenas no NT mostrou que este domínio foi convertido em uma estrutura de folha β.Os espectros dependentes do tempo de NT em solução mostraram uma diminuição uniforme na intensidade do sinal (Fig. 4c), e a RMN de estado sólido de hidrogéis de NT mostrou que a maioria dos resíduos de NT foram convertidos em estruturas de folha β (Fig. 4d).A conformação do 2Rep não pôde ser determinada separadamente devido à sua tendência de agregação.No entanto, os espectros de RMN no estado sólido dos hidrogéis NTCT e His-NT2RepCT pareciam muito semelhantes (Fig. 4b; Figura 6b suplementar), sugerindo que 2Rep contribuiu pouco para a parte estrutural do hidrogel His-NT2RepCT.Para hidrogéis CT, descobriu-se que existiam hélices α, folhas β e estruturas secundárias helicoidais aleatórias (Figura 6d suplementar).Isto sugere que algumas partes do CT permanecem hélices α enquanto outras se tornam folhas β.Assim, os resultados da espectroscopia de RMN sugerem que o NT é importante para a formação de hidrogel e também se transforma em uma conformação de folha β após fusão com 2Rep e CT.Consistente com isso, descobrimos recentemente que os zíperes espaciais amilóides provavelmente se formam em todas as cinco hélices do domínio NT, e o algoritmo Waltz previu uma região amiloidogênica na hélice 1 (Fig. 4e).
Espectros 2D de solução 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT antes (azul) e 19 horas após a incubação (vermelho) a 37°C.Picos cruzados individuais no espectro vermelho e F24, G136, poliA no espectro azul são indicados por símbolos de aminoácidos de uma única letra e números de resíduos.As inserções mostram a dependência da intensidade do sinal no tempo para resíduos selecionados dos domínios NT, 2Rep e CT.b Espectros de radiofrequência de estado sólido (RFDR) de hidrogéis His-NT2RepCT.As correlações dos resíduos Cα/Cβ observadas nos espectros de RFDR foram determinadas por comparação com os desvios químicos do peptídeo modelo e valores derivados de estatísticas82,83 e suas estruturas secundárias.SSB – banda lateral rotativa.c Espectros unidimensionais de solução NT 15N-HSQC 10 mg/mL durante incubação a 37 °C por 36 horas.A inserção mostra a intensidade volumétrica em função do tempo.d Espectros RFDR de estado sólido de hidrogéis NT.As correlações dos resíduos Cα/Cβ e suas estruturas secundárias observadas nos espectros de RFDR são indicadas.e Com base no perfil de propensão à fibrilação NT45.79 do banco de dados Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).A energia Rosetta da janela espacial de mudança de raio do hexapeptídeo é mostrada em kcal/mol.As barras vermelhas indicam hexapeptídeos com alta propensão à fibrose (energia Rosetta abaixo de -23 kcal/mol; abaixo da linha pontilhada).As barras verdes indicam fragmentos com energias Rosetta acima do limiar e, portanto, menos propensos a formar zíperes estéricos.Fragmentos contendo prolina foram excluídos da análise (sem colunas).Os quadrados indicam áreas de amiloidose previstas pelo algoritmo Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).A sequência de resíduos de aminoácidos do NT está no topo, e os tipos de resíduos encontrados na estrutura secundária β (determinados por espectroscopia de RMN no estado sólido) são mostrados em vermelho.As posições das cinco hélices α do NT são designadas como (H1-H5)28.
Em pH <6,5, o HT dimeriza, sendo resistente à desnaturação induzida pelo calor ou pela uréia18.Para elucidar como a dimerização e a estabilidade do NT afetam a gelificação, as soluções contendo 100 mg/ml de NT foram controladas em pH 8, 7 e 6 usando o teste de inversão do frasco.As amostras de NT incubadas a pH 8 e 7 gelificaram após 30 min a 37 ° C, mas o gel de pH 8 permaneceu límpido, enquanto o gel de pH 7 mostrou um precipitado visível (Fig. 5a).Em contraste, uma solução contendo HT a pH 6 não formou um gel, e um grande precipitado pôde ser observado após 20 minutos a 37°C.Isto sugere que os próprios dímeros e/ou a sua maior estabilidade em comparação com os monómeros evitam a gelificação.A formação de um precipitado para NT em pH 7 e 6 não era esperada, pois foi relatado que NT é solúvel a 200 mg/ml27, redobra-se facilmente após desnaturação térmica e também retém uma hélice α em valores mais baixos de pH 18. Uma explicação provável para essas discrepâncias é que os experimentos relatados anteriormente foram realizados em temperatura ambiente ou inferior, ou em concentrações proteicas relativamente baixas .
Teste de inversão de frasco NT (100 mg/mL) em pH 8, 7, 6 e NaCl 154 mM (pH 8) após incubação a 37°C.b Espectros NT CD com e sem NaF 154 mM e NaCl 154 mM, respectivamente.A elipticidade molar a 222 nm é convertida em uma proporção de dobras naturais.c Ensaio de inversão de NT (100 mg/mL) NT* (37 °C e 60 °C), NTA72R (37 °C) e His-NT-L6 (37 °C e 60 °C).d Espectros de CD de mutantes NT NT*, NTA72R e His-NT-L6.A elipticidade molar a 222 nm é convertida em uma proporção de dobras naturais.e Teste de inversão de NTFlSp, NTMiSp e NTMiSp reduzido (100 mg/mL).Barra de escala 5 mm.Espectros de CD de NT, NTFlSp, NTMiSp e NTMiSp reduzido.A elipticidade molar a 222 nm é convertida em uma proporção de dobras naturais.Os espectros completos de NT a 25 °C e 95 °C são mostrados na Figura Suplementar 8.
A concentração fisiológica de sal determina interações eletrostáticas entre subunidades de NT e dimerização da transferência de NT para pH mais baixo18.Descobrimos que a presença de NaCl e NaF 154 mM de fato inibiu a gelificação, respectivamente (Fig. 5a, b; Fig. Complementar 2b) e que esses sais aumentaram a estabilidade térmica dos monômeros de NT (Fig. 5b, Fig. Complementar 8) .Também sugere que o aumento da estabilidade, em vez da dimerização, evita a formação de gel.
Para explorar ainda mais o papel da dimerização e estabilidade de proteínas na gelificação, utilizamos dois mutantes, NT* e NTA72R, que também permanecem monoméricos em pH baixo 28,30.NT* é um mutante de reversão de carga dupla no qual a distribuição de carga dipolar aparente do monômero é achatada, o que evita a dimerização e aumenta drasticamente a estabilidade do monômero.NTA72R é um dipolo carregado, mas o Ala substituído por Arg está localizado no limite do dímero, então as mutações interferem nas interações das subunidades necessárias para a dimerização.Após incubação a 37°C, o NT* não formou um hidrogel, enquanto o NTA72R formou um gel opaco durante 15 min (Fig. 5c).Uma vez que tanto o NT * como o NTA72R não podem dimerizar, mas diferem na estabilidade do monómero (Fig. 5d), estes resultados sugerem fortemente que a elevada estabilidade termodinâmica impede a gelificação do NT.Isto também é apoiado pelo fato de que o HT* forma um gel quando é instável em alta temperatura (após 8 min a 60°C; Fig. 5c).Foi anteriormente demonstrado que o elevado teor de metionina no NT liquefaz a sua dobragem natural e que seis substitutos de Met para Leu (referidos aqui como His-NT-L6) estabilizam fortemente o monómero NT46.Com base no pressuposto de que a flexibilidade estrutural é necessária para a formação de gel NT, descobrimos que o mutante estável His-NT-L6 não gelificou a 37 ° C (Figura 5c, d).No entanto, His-NT-L6 também formou um gel após incubação a 60 ° C durante 60 min (Fig. 5c).
A capacidade do NT de se transformar em estruturas de folha β e formar hidrogéis parece aplicar-se a alguns, mas não a todos os domínios NT da espidroína.NTs de diferentes tipos de seda e espécies de aranhas, Trichonephila clavipes (NTFlSp), formaram géis apesar de seu teor relativamente baixo de metionina e alta estabilidade térmica (Fig. 5e, f e Tabela Suplementar 2).Em contraste, o NT da pequena proteína ampular espidroína de Araneus ventricosus (NTMiSp) com baixa estabilidade térmica e alto teor de metionina não formou hidrogéis (Tabela Suplementar 2 e Fig. 5e, f).Este último pode estar associado à presença de ligações dissulfeto intramoleculares29,47.Consistentemente, quando as ligações dissulfeto do NTMiSp foram reduzidas, formou-se um hidrogel após incubação a 37 ° C por 10 min (Fig. 5e).Concluindo, deve-se notar que a flexibilidade estrutural é um critério importante, mas não o único, para a formação de um gel a partir da NT.Outro fator que pode ser relevante é a propensão a formar fibrilas amilóides, e a análise com o banco de dados de zíper e o algoritmo Waltz mostrou uma correlação entre a capacidade de formar géis e a presença de regiões amiloidogênicas, bem como a extensão das regiões previstas para formar zíperes estéricos.Houve correlação (Tabela Suplementar 2 e Figura Complementar 9).
A capacidade do NT de formar fibrilas e géis sob condições favoráveis ​​nos levou a levantar a hipótese de que as fusões de NT com outros fragmentos de proteínas ainda podem formar géis com plena função de parceiros de fusão.Para testar isso, introduzimos a proteína verde fluorescente (GFP) e a purina nucleosídeo fosforilase (PNP) no terminal C do NT, respectivamente.As proteínas de fusão resultantes foram expressas em E. coli com rendimentos finais muito elevados (culturas em frasco agitado de 150 mg/L e 256 mg/L para His-NT-GFP e His-NT-PNP, respectivamente), consistente com o que foi mostrado para outras proteínas fundidas com NT Ref.30. As proteínas de fusão His-NT-GFP (300 mg/mL) e His-NT-PNP (100 mg/mL) formaram géis após 2 horas e 6,5 horas a 37°C e, mais importante, a fração GFP permaneceu inalterada.observado após a gelificação, com> 70% da intensidade de fluorescência inicial permanecendo após a gelificação (Fig. 6a).Para medir a atividade do PNP em soluções e géis his-NT-PNP, tivemos que diluir a proteína de fusão com NT porque a atividade enzimática da preparação pura estava fora da faixa de detecção do ensaio em concentrações gelificantes.O gel formado com uma mistura contendo 0,01 mg/mL de His-NT-PNP e 100 mg/mL de NT reteve 65% da atividade enzimática inicial das amostras pré-incubadas (Fig. 6b).O gel permaneceu intacto durante a medição (Figura 10 suplementar).
a Intensidade relativa de fluorescência antes e depois da gelificação de His-NT-GFP (300 mg/mL) e frasco invertido contendo hidrogel His-NT-GFP (300 mg/mL) sob luz visível e UV.Os pontos mostram medições individuais (n = 3), as barras de erro mostram o desvio padrão.O valor médio é mostrado no centro das barras de erro.b A atividade do PNP foi obtida por análise fluorométrica utilizando soluções e géis consistindo de NT (100 mg/ml) e uma mistura contendo 0,01 mg/ml de his-NT-PNP e 100 mg/ml de novos dólares de Taiwan.A inserção mostra um frasco invertido contendo um hidrogel contendo His-NT-PNP (barra de escala de 5 mm).
Aqui, relatamos a formação de hidrogéis a partir de NT e outras proteínas spidroin recombinantes por incubação de uma solução proteica a 37°C (Figura 1).Mostramos que a gelificação está associada à transformação de hélices α em camadas β e à formação de fibrilas semelhantes a amilóides (Figs. 3 e 4).Esse achado é surpreendente, pois os NTs são feixes globulares enrolados de cinco hélices, conhecidos por sua solubilidade extremamente alta e alta estabilidade em concentrações >200 mg/mL a 4°C por vários dias27.Além disso, os NTs redobram-se prontamente após a desnaturação pelo calor em baixas concentrações de proteína em µM.De acordo com nossos resultados, a formação de fibrilas requer uma combinação de concentração de proteína> 10 mg/mL e temperatura ligeiramente elevada (Fig. 1).Isto é consistente com a ideia de que as fibrilas amilóides podem formar-se a partir de proteínas dobradas globularmente que estão num estado parcialmente desdobrado devido a flutuações térmicas sob condições fisiológicas 48 .Exemplos de proteínas que sofrem esta conversão incluem insulina49,50, β2-microglobulina, transtirretina e lisozima51,52,53.Embora o NT seja uma hélice α em seu estado nativo, aproximadamente 65% da cadeia polipeptídica é compatível com a formação de zíper estérico (Fig. 4e) 45 .Como o monômero é dinamicamente móvel46, ele pode expor essas potenciais regiões amiloidogênicas a temperaturas moderadamente elevadas e em altas concentrações de proteína total pode atingir uma concentração crítica para a formação de fibrilas amilóides54.Seguindo esse raciocínio, encontramos uma correlação negativa entre a concentração de espidroína e o tempo de gelificação (Fig. 1c), e se a conformação monomérica do NT for estabilizada por mutações (NT *, His-NT-L6) ou por adição de sal, pode prevenir o formação de hidrogéis (Fig. 5).
Na maioria dos casos, as fibrilas amilóides desaparecem da solução como precipitado, mas sob certas condições podem formar hidrogéis55,56,57.As fibrilas formadoras de hidrogel normalmente têm uma alta proporção de aspecto e formam redes tridimensionais estáveis ​​através do emaranhamento molecular,55,58 consistente com nossos resultados.Para a formação de hidrogel in vitro, as proteínas são frequentemente desdobradas total ou parcialmente, por exemplo, por exposição a solventes orgânicos, alta temperatura (70-90°C) e/ou baixo pH (1,5-3,0)59,60,61,62.Os hidrogéis de espidroína aqui descritos não requerem processamento severo, nem requerem agentes de reticulação para estabilizar os hidrogéis.
Foi relatado anteriormente que repetições de espidroína e QDs, que parecem sofrer troca de folhas β durante a fiação da seda, formam hidrogéis.Em comparação com nossas descobertas, os tempos de incubação e/ou temperaturas de incubação foram significativamente mais longos ou mais altos, respectivamente, e os hidrogéis resultantes eram frequentemente opacos (Figura 7 e Tabela Suplementar 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Além dos tempos de gelificação rápidos, os hidrogéis NT >300 mg/mL (30%) superaram todos os outros hidrogéis de proteína de seda de aranha recombinante descritos, bem como hidrogéis naturais, como gelatina, alginato (2%), ágar (0,5% ) e colágeno.(0,6%) (Figura 7 e Tabelas Suplementares 1 e 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
O tempo de gelificação e o módulo de elasticidade dos hidrogéis neste estudo foram comparados com outros hidrogéis à base de spidroína e hidrogéis naturais selecionados.As referências são fornecidas juntamente com uma descrição das condições de gelificação.APS Persulfato de amônio, temperatura ambiente.Dados 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
As aranhas parecem ter desenvolvido maneiras de evitar que a espidroína gelifique durante o armazenamento.Apesar da alta concentração de proteína na glândula da seda, a grande região de repetição associada ao domínio terminal significa que a concentração aparente de NT e CT na glândula corresponde a aproximadamente 10-20 mg/ml, no limite deste estudo.necessário para a formação de hidrogel observada in vitro.Além disso, concentrações semelhantes de sais 16 estabilizaram o NT, como nas glândulas da seda (Fig. 5b).A conformação do NT foi estudada no citosol de E. coli e descobriu-se que está mais firmemente dobrada do que quando examinada in vitro, indicando ainda que o sal ou outros fatores impedem a sua agregação in vivo.No entanto, a capacidade dos NTs de se transformarem em fibrilas de folha β pode ser importante para a formação de filamentos e deve ser investigada em estudos futuros.
Além dos novos aspectos da formação de fibrilas e hidrogel do tipo NT-amilóide observados neste estudo, também mostramos que esse fenômeno pode ter aplicações biotecnológicas e biomédicas (Fig. 8).Como prova de conceito, combinamos NT com GFP ou PNP e mostramos que a proteína de fusão também forma hidrogéis quando incubada a 37 °C e que as frações GFP e PNP retêm em grande parte sua atividade após a gelificação (Figura 6).As nucleosídeos fosforilases são importantes catalisadores na síntese de análogos de nucleosídeos75, o que torna nossa descoberta relevante para a indústria biofarmacêutica.O conceito de expressar proteínas de fusão que formam hidrogéis transparentes sob condições favoráveis ​​permite a criação de hidrogéis funcionalizados com propriedades favoráveis ​​para uma ampla gama de aplicações, como imobilização de enzimas, liberação controlada de medicamentos e engenharia de tecidos.Além disso, NT e NT* são marcadores de expressão eficientes, o que significa que NT e suas variantes podem ser usados ​​para produção de alto rendimento de proteínas de fusão solúveis e subsequente criação de proteínas alvo imobilizadas em hidrogéis 3D.
NT é solúvel, α-helicoidal e estável em baixas concentrações (µM) e 37°C.À mesma temperatura, mas em concentrações crescentes (>10 mg/ml), o NT forma géis constituídos por fibrilas semelhantes a amilóides.As proteínas de fusão NT também formam géis fibrilares com fragmentos de fusão totalmente funcionais, permitindo que várias proteínas sejam imobilizadas em hidrogéis 3D usando NT.Parte inferior: NT (PDB: 4FBS) e ilustrações de redes de fibra e estruturas de proteínas associadas (assumidas e não desenhadas em escala, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
As construções (ver Tabela Suplementar 4 para uma lista completa incluindo sequências de aminoácidos) foram clonadas no plasmídeo pT7 e transformadas em E. coli BL21 (DE3).E. coli contendo plasmídeos modificados foram inoculados em caldo Luria suplementado com canamicina (70 mg/l) e cultivados durante a noite a 30°C e 250 rpm.A cultura foi então inoculada 1/100 em meio LB contendo canamicina e cultivada a 30°C e 110 rpm até a DO600 atingir 0,8.Para estudos de RMN, as bactérias foram cultivadas em meio mínimo M9 contendo 2 g de D-glicose 13C (Aldrich) e 1 g de cloreto de amônio 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) para marcação de proteínas com isótopos.Abaixe a temperatura para 20 graus Celsius e induza a expressão proteica com isopropiltiogalactopiranosídeo 0,15 mM (concentração final).Após expressão proteica durante a noite, as células foram colhidas a 7278xg, 4°C durante 20 min.Os sedimentos celulares foram ressuspensos em Tris-HCl 20 mM, pH 8, e congelados até utilização posterior.As células descongeladas foram lisadas utilizando um disruptor celular (máquinas da série TS, Constant Systems Limited, Inglaterra) a 30 kPa.Em seguida, os lisados ​​foram centrifugados a 25.000 g durante 30 minutos a 4°C.Para NTMiSp, o sedimento foi então ressuspenso em ureia 2 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8, e sonicado por 2 min (2 s ligado/desligado, 65%), depois centrifugado novamente a 25.000 xg, 4°C dentro 30 minutos.O sobrenadante foi carregado em uma coluna Ni-NTA, lavado com Tris-HCl 20 mM, imidazol 2 mM, pH 8, e finalmente a proteína foi eluída com Tris-HCl 20 mM, imidazol 200 mM, pH 8. Para gerar NT2RepCT e NTCT, a digestão da trombina introduz o sítio (ThrCleav) entre His e NT.Os locais de clivagem da trombina também estão presentes em His-NT-ThrCleav-2Rep (produz 2Rep), His-tioredoxina-ThrCleav-NT (produz NT), His-tioredoxina-ThrCleav-CT (produz CT), His-Thioredoxina-ThrCleav-NT .* (produz NT*), His-Thioredoxina-ThrCleav-NTA72R (produz NTA72R), His-Thioredoxina-ThrCleav-NTFlSp (produz NTF1Sp) e His-Enxofre Redoxina-ThrCleav-NTMiSp (produz NTMiSp).As construções foram digeridas com trombina (1:1000) e dialisadas durante a noite a 4°C com Tris-HCl 20 mM, pH 8, usando uma membrana de diálise Spectra/Por com um limiar de peso molecular de 6-8 kDa.Após a diálise, a solução é carregada em uma coluna de Ni-NTA e o efluente contendo a proteína de interesse é coletado.As concentrações de proteínas foram determinadas medindo a absorbância UV a 280 nm utilizando o coeficiente de extinção de cada proteína, exceto NTF1Sp, que utilizou o ensaio de Bradford de acordo com o protocolo do fabricante.A pureza foi determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (4-20%) e coloração com azul brilhante de Coomassie.As proteínas foram concentradas utilizando filtros centrífugos (VivaSpin 20, GE Healthcare) a 4000 xg com um corte de peso molecular de 10 kDa em ciclos de 20 minutos.
Descongelar a solução proteica e pipetar cuidadosamente 150 ul para um frasco de septo transparente de 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Os tubos foram tampados e selados com parafilme para evitar evaporação.As amostras (n = 3) foram incubadas a 37°C ou 60°C e periodicamente invertidas para observar a gelificação.As amostras que não gelificaram foram incubadas durante pelo menos uma semana.Reduza as ligações dissulfeto NTMiSp com 10 mM DTT por 10 μM de proteína.Para analisar a gelificação dos revestimentos naturais de seda de aranha, a aranha ponte sueca foi cortada, as duas principais glândulas ampuladas foram colocadas em 200 μl de tampão Tris-HCl 20 mM pH 8 e cortadas para permitir que o revestimento se separasse das glândulas..O conteúdo das glândulas é dissolvido em tampão, 50 µl para determinação do peso seco (por incubação de frascos abertos a 60 °C até peso constante) e 150 µl para gelificação a 37 °C.
A geometria/ferramenta de medição é feita de aço inoxidável utilizando uma placa paralela com diâmetro superior de 20 mm e folga de 0,5 mm.Aqueça a amostra de 25 °C a 45 °C e de volta a 25 °C a uma taxa de 1 °C por minuto usando uma placa Peltier de fundo de aço inoxidável.As medições vibracionais foram realizadas na frequência de 0,1 Hz e na região viscoelástica linear do material nas deformações de 5% e 0,5% para amostras de 100 mg/mL e 300–500 mg/mL, respectivamente.Use uma câmara de umidade personalizada para evitar a evaporação.Os dados foram analisados ​​usando Prism 9.
Para coletar espectros infravermelhos (IR) em temperatura ambiente de 800 a 3900 cm–1.O dispositivo ATR, bem como o caminho da luz através do espectrômetro, é purgado com ar filtrado seco antes e durante o experimento.Soluções (500 mg/mL para minimizar picos de absorção de água nos espectros) foram pipetadas sobre os cristais e géis (500 mg/mL) foram formados antes da medição e depois transferidos para os cristais (n = 3).Foram registradas 1.000 varreduras com resolução de 2 cm-1 e ciclo de trabalho zero de 2. A segunda derivada foi calculada usando OPUS (Bruker) usando uma faixa de suavização de nove pontos.Os espectros foram normalizados para a mesma região de integração entre 1720 e 1580 cm-1 usando F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopia Software”.Na espectroscopia ATR-IR, a profundidade de penetração de um feixe infravermelho em uma amostra depende do número de onda, resultando em absorção mais forte em números de onda mais baixos do que em números de onda mais altos.Estes efeitos não foram corrigidos para os espectros mostrados nas Figs.3 porque são muito pequenos (Fig. Complementar 4).Os espectros corrigidos para esta figura foram calculados usando o software Bruker OPUS.
Em princípio, uma quantificação abrangente das conformações proteicas é possível após a desconvolução confiável dos componentes dentro do pico da amida I.No entanto, alguns obstáculos surgem na prática.O ruído no espectro pode aparecer como picos (falsos) durante a desconvolução.Além disso, o pico devido à curvatura da água coincide com a posição do pico da amida I e pode ter uma magnitude semelhante para amostras contendo grande quantidade de água, como o gel aquoso aqui estudado.Portanto, não tentamos decompor completamente o pico da amida I, e nossas observações só devem ser consideradas em apoio a outros métodos, como a espectroscopia de RMN.
Soluções de 50 mg/ml de NT e His-NT2RepCT foram gelificadas durante a noite a 37°C.O hidrogel foi então diluído com Tris-HCl 20 mM (pH 8) até uma concentração de 12,5 mg/ml, bem agitado e pipetado para quebrar o gel.Em seguida, o hidrogel foi diluído 10 vezes com Tris-HCl 20 mM (pH 8), 5 μl da amostra foram aplicados em uma grade de cobre revestida com formvar e o excesso de amostra foi removido com papel absorvente.As amostras foram lavadas duas vezes com 5 µl de água MilliQ e coradas com formato de uranila a 1% por 5 minutos.Remova o excesso de mancha com papel absorvente e seque a tela ao ar.A imagem foi realizada nessas grades usando um FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN operando a 100 kV.As imagens foram gravadas com ampliações de x 26.500 e x 43.000 usando uma câmera CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Alemanha).Para cada amostra (n = 1), foram registradas de 10 a 15 imagens.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) foi utilizado para análise de imagens e medição de diâmetros de fibras (n = 100, fibras diferentes).O Prism 9 foi usado para realizar testes t não pareados (bicaudais).As médias das fibrilas His-NT2RepCT e NT foram 11,43 (DP 2,035) e 7,67 (DP 1,389) nm, respectivamente.O intervalo de confiança (95%) é de -4,246 a -3,275.graus de liberdade = 198, p < 0,0001.
80 µl de amostras líquidas contendo 10 µM de tioflavina T (ThT) foram medidos em triplicado (n = 3) sob condições estáticas usando placas de fundo transparente de fundo preto de 96 poços Corning (Corning Glass 3881, EUA).As diferenças de fluorescência foram registadas utilizando um filtro de excitação de 440 nm e um filtro de emissão de 480 nm (FLUOStar Galaxy da BMG Labtech, Offenburg, Alemanha).O sinal ThT não foi saturado nem extinto, pois experimentos com diferentes concentrações de ThT foram realizados sem alterar a intensidade do sinal.Grave a absorvância a 360 nm para medição de neblina.Para experimentos de semeadura, géis de 100 mg/mL foram formados a 37°C, ressuspensos e usados ​​para semeadura em proporções molares de 5%, 10% e 20%.Os dados foram analisados ​​usando Prism 9.
Descongelar estoques de His-NT2RepCT e NT >100 mg/mL em gelo e filtrar através de um filtro de 0,22 μm.As concentrações foram calculadas medindo a absorvância a 280 nm utilizando Nanodrop.Em poços de uma placa preta não ligante de 96 poços (Corning) com fundo transparente, as amostras foram diluídas para 20 mg/ml em Tris-HCl 20 mM pH 8 e misturadas com 5 μM ThT (concentração final), concentração total da amostra Volume de 50 μl.As amostras foram fotografadas a cada 10 minutos a 37 ° C em um microscópio CellObserver (Zeiss) com canal de luz transmitida e conjuntos de filtros de excitação e emissão FITC para imagens ThT.Uma lente 20x/0,4 é usada para geração de imagens.Zen Blue (Zeiss) e ImageJ (//imagej.nih.gov/) foram utilizados para análise de imagens.Os géis também foram preparados a partir de soluções de NT e His-NT2RepCT em uma concentração de 50 mg/mL contendo Tris 20 mM pH 8 e ThT 5 µM e incubados a 37°C por 90 min.Os pedaços de gel foram transferidos para um novo poço contendo Tris 20 mM, pH 8 e ThT 5 μM em uma placa de fundo transparente preta não ligante de 96 poços.Adquira imagens de fluorescência verde e campo brilhante com ampliação de 20x/0,4.ImageJ foi usado para análise de imagens.
Os espectros de RMN de solução foram obtidos a 310 K em um espectrômetro Bruker Avance Neo de 600 MHz equipado com uma Cryossonda de Campo Gradiente Pulsado de Ressonância Quadrupolo QCI (HFCN).Amostras de RMN contendo 10 mg/mL de proteína homogênea marcada com 13C, 15N, dissolvida em Tris-HCl 20 mM (pH 8), 0,02% (p/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Deslocamentos químicos de NT2RepCT em pH 6,7 foram usados ​​para atribuir o pico 23 no espectro 2D de 15N-HSQC.
Os espectros de RMN sólidos giratórios em ângulo mágico (MAS) de hidrogéis marcados com 13C e 15N foram registrados em um espectrômetro Bruker Avance III HD a 800 MHz equipado com uma sonda sem elétrons 13C/15N{1H} de 3,2 mm.A temperatura da amostra foi controlada usando um fluxo de gás de temperatura variável a 277 K. Os espectros de ressonância rotacional dipolo bidimensional (DARR) 76 e reconexão de radiofrequência (RFDR) 77 foram adquiridos nas frequências MAS de 12, 5 kHz e 20 kHz, respectivamente.A polarização cruzada (CP) de 1H a 13C foi realizada usando uma rampa linear de 60,0 a 48,0 kHz a 1H, 61,3/71,6 kHz a 13C (a 12,5/20 kHz MAS) e tempo de contato de 0,5–1 ms.O desacoplamento Spinal6478 a 73,5 kHz foi utilizado durante a coleta de dados.O tempo de aquisição foi de 10 milissegundos e o atraso do ciclo foi de 2,5 segundos.As correlações Cα/Cβ de ligação simples observadas nos espectros de RFDR foram atribuídas com base nos desvios químicos característicos do tipo resíduo e nas correlações multiligadas nos espectros de DARR.
O banco de dados Zipper79 (//services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) foi usado para avaliar tendências de vibração e energia Rosetta para NT, NTFlSp e NTMiSp.O banco de dados Zipper calcula o Rosetta Energy80, que combina várias funções de energia livre para modelar e analisar a estrutura da proteína.Um nível de energia de -23 kcal/mol ou inferior indica uma alta tendência a fibrilar.A energia mais baixa significa mais estabilidade das duas cadeias β na conformação do zíper.Além disso, o algoritmo Waltz foi utilizado para prever regiões amiloidogênicas em NT, NTFlSp e NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
A solução de proteína NT foi misturada com tampão de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES) a pH 5,5 e 6,0 para diminuir o pH para pH 6 e 7, respectivamente.A concentração final de proteína foi de 100 mg/ml.
As medições foram realizadas em um espectrômetro J-1500 CD (JASCO, EUA) utilizando uma cubeta de 300 μL com caminho óptico de 0,1 cm.As proteínas foram diluídas para 10 μM (n = 1) em tampão fosfato 20 mM (pH 8).Para analisar a estabilidade proteica na presença de sal, as proteínas foram analisadas na mesma concentração (n = 1) em tampão fosfato 20 mM (pH 8) contendo NaF ou NaCl 154 mM, respectivamente.As varreduras de temperatura foram registradas em 222 nm de 25°C a 95°C com uma taxa de aquecimento de 1°C/min.A proporção de proteínas dobradas nativamente foi calculada usando a fórmula (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Além disso, cinco espectros foram registrados para cada amostra de 260 nm a 190 nm a 25°C e após aquecimento a 95°C.Cinco espectros foram calculados, suavizados e convertidos em elipticidade molar.Os dados foram analisados ​​usando Prism 9.
A intensidade de fluorescência de His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) foi medida em triplicata (n = 3) em placas Corning de 96 poços com fundo preto transparente (Corning Glass 3881, EUA) sob condições estáticas.Meça as amostras com um leitor de placas baseado em fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 395 nm e registre a emissão a 509 nm antes da gelificação e 2 horas depois a 37°C.Os dados foram analisados ​​com Prism 9.
O kit de ensaio de atividade de nucleosídeo fosforilase de purina (método fluorométrico, Sigma Aldrich) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante.Para medir a atividade em géis e soluções contendo His-NT-PNP, misture 10 ng de His-NT-PNP com 100 mg/mL NT até um volume total de 2 μL porque o gel deu um sinal acima do intervalo de detecção do conjunto.Foram incluídos controles para géis e soluções sem His-NT-PNP.As medições foram realizadas duas vezes (n = 2).Após a medição da atividade, a mistura de reação foi removida e o gel fotografado para garantir que o gel permanecesse intacto durante a medição.Os dados foram analisados ​​usando Prism 9.
Para obter mais informações sobre o desenho do estudo, consulte o resumo do estudo da Nature vinculado a este artigo.
As Figuras 1 e 2 apresentam os dados iniciais.1c, 2a – c, 3a, b, e – g, 4, 5b, d, f e 6, Figs.3, fig. suplementar.5a, d, fig. suplementar.6 e fig. suplementar.8. Dados Os dados deste estudo estão hospedados no banco de dados Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Os dados de RMN obtidos neste estudo foram postados no repositório BMRBig sob o ID de entrada bmrbig36.As estruturas do GFP e PNP foram retiradas do PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. e Johansson, J. Spinning artificial spider silk.Química Nacional.biologia.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.O genoma da Nephila clavipes destaca a diversidade dos genes da seda da aranha e sua expressão complexa.Genette Nacional.49, 895–903 (2017).